唐 云， 劉漢清

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046)

散結(jié)鎮(zhèn)痛片是由同方 (三七、浙貝母、龍血竭、薏苡仁)全粉末膠囊劑改制而成的半膏片，用于子宮內(nèi)膜異位癥所致的繼發(fā)性痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、盆腔包塊和不孕等病癥，療效確切。主藥三七的質(zhì)控研究已另文發(fā)表［1］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)散結(jié)鎮(zhèn)痛片的貝母素甲、貝母素乙的定量測(cè)定進(jìn)行研究，為進(jìn)一步完善其質(zhì)控指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器、對(duì)照品與試劑

1.1 儀器 Waters 2695液相色譜儀，Waters2420 ELS Detector(Waters科技有限公司);BP211D電子天平 (十萬(wàn)分之一);SYZ-A石英亞沸高純水蒸餾器 (江蘇信達(dá)儀器廠);HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 (江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 對(duì)照品 貝母素甲 (批號(hào)1022-050123)、貝母素乙 (批號(hào)110751-200504)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供定量測(cè)定用。

1.3 試劑 乙腈、甲醇 (色譜純，購(gòu)自美國(guó) Honeywell公司)，乙醇、鹽酸、三氯甲烷等 (分析純，購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑有限公司)。

2 散結(jié)鎮(zhèn)痛片及其陰性樣品制備

2.1 飲片 浙貝母、三七、薏苡仁、龍血竭 (購(gòu)自安徽亳州)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)王春根教授鑒定，均符合《中國(guó)藥典》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［2-3］。

2.2 散結(jié)鎮(zhèn)痛片制備 取處方量龍血竭 (124 g)粉碎，過(guò)100目篩，備用;另取浙貝母 (200 g)、三七 (124 g)、薏苡仁 (352 g)粉碎成粗粉，用90%乙醇回流提取兩次，每次10倍量提取2 h，合并濾液，減壓回收乙醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.00～1.10(50℃)的稠膏;所得稠膏與龍血竭細(xì)粉混勻，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加適量淀粉混勻，制粒，干燥，加0.5%硬脂酸鎂，混勻，壓制成1 000片 (0.3 g/片)(制備工藝研究另文發(fā)表)。3批 供 試 品 批 號(hào) 分 別 為 20100801、20100802、20100803。

2.3 缺浙貝母散結(jié)鎮(zhèn)痛片制備 取處方比例量龍血竭 (124 g)粉碎，過(guò)100目篩，備用;另取處方比例量三七 (124 g)、薏苡仁 (352 g)粉碎成粗粉，用90%乙醇回流提取兩次，以下制法同散結(jié)鎮(zhèn)痛片制備方法。

3 方法與結(jié)果

3.1 供試液的制備

3.1.1 混合對(duì)照品貯備液的制備 精密稱取貝母素甲、貝母素乙對(duì)照品適量，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制得質(zhì)量濃度為每1 mL含貝母素甲0.340 4 mg、貝母素乙0.246 4 mg的混合對(duì)照品貯備液。

3.1.2 供試品溶液的制備 取散結(jié)鎮(zhèn)痛片研細(xì)(過(guò)80目)，取2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入含1%HCl的30%乙醇溶液100 mL，精密稱定，超聲1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用含1%HCl的30%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，精密量取上清液75 mL置250 mL分液漏斗中，加氨水15 mL，用三氯甲烷250 mL萃取5次，每次50 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3.1.3 缺浙貝母陰性溶液的制備 取缺浙貝母散結(jié)鎮(zhèn)痛片研細(xì) (過(guò)80目)，取2.0 g，照供試品溶液制備方法制備，即得。

3.1.4 浙貝母溶液的制備 取浙貝母粉末約2 g，精密稱定，置燒瓶中，加濃氨試液4 mL浸潤(rùn)1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇 (4∶1)的混合溶液40 mL，稱定質(zhì)量，混勻，置80℃水浴中加熱回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，加上述混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芤喝芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性［4-13］Thermo Hypersil Gold C18ODS色譜柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為乙腈-0.06%二乙胺溶液 (70∶30);蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;載氣體積流量2.2 L/min;漂移管溫度85.0℃;進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按貝母素甲峰計(jì)算，應(yīng)不低于5 000。

3.2.2 專屬性考察 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液、藥材溶液，按3.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果表明，貝母素甲、貝母素乙峰與其他色譜峰分離度均大于1.5，達(dá)到基線分離，陰性無(wú)干擾，結(jié)果見圖1。

3.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品貯備液0.5、1、2、4、6、8、10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得各質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液，按3.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，分別將峰面積及相應(yīng)的進(jìn)樣量取以10為底的對(duì)數(shù)，經(jīng)EXCEL線性回歸，以峰面積的對(duì)數(shù) (Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量的對(duì)數(shù) (X)為橫坐標(biāo)，得貝母素甲回歸方程為:Y=1.532 5X+1.117 8，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7;得貝母素乙回歸方程為:Y=1.525 3X+1.065 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4。貝母素甲、貝母素乙分別在170.2～3 404 ng、123.2～2 464 ng范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取散結(jié)鎮(zhèn)痛片 (批號(hào)20100801)適量，研細(xì) (過(guò)80目)，精密稱定，按3.1.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，照3.2.1項(xiàng)下方法，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果貝母素甲峰面積分別為823 695、 814 818、 807 731、 818 070、 807 928;貝母素乙峰面積分別為305 308、307 020、294 844、298 209、298 231，以峰面積計(jì)算進(jìn)樣精密度，RSD分別為0.84%、1.73%，表明儀器的精密度良好。

3.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取散結(jié)鎮(zhèn)痛片 (批號(hào)20100801)適量，研細(xì) (過(guò)80目)，精密稱定，按3.1.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，照3.2.1項(xiàng)下方法分別在0、1、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，結(jié)果貝母素甲峰面積分別為813 695、807 731、807 928、815 293、802 256;貝母素乙峰面積分別為300 308、294 844、298 231、301 566、295 032，以峰面積計(jì)算，結(jié)果貝母素甲、貝母素乙的RSD分別為0.65%、1.02%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 樣品 (A)、陰性樣品 (B)、浙貝母藥材 (C)和混合對(duì)照品溶液 (D)HPLC-ELSD色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of sample(A)，negative sample(B)，F(xiàn)ritillariae thunbergii Bulbus(C)and reference substance(D)

3.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取散結(jié)鎮(zhèn)痛片適量，研細(xì)(過(guò)80目)，平行取6份，分別精密稱定，按3.1.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，照3.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果貝母素甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.397、0.396、0.396、0.396、0.393、0.388 mg/g，貝母素乙的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分 別 為 0.240、0.238、0.235、0.239、0.242、0.239 mg/g，兩者的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.394 mg/g、0.239 mg/g，RSD分別為0.90%、1.05%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取散結(jié)鎮(zhèn)痛片適量，研細(xì)(過(guò)80目)，平行取9份，每份1.0 g，精密稱定。每3份為1組，按重復(fù)性中貝母素甲、貝母素乙含有量的0.8倍、1.0倍、1.2倍，分別準(zhǔn)確加入貝母素甲對(duì)照品、貝母素乙混合對(duì)照品溶液 (貝母素甲、貝母素乙質(zhì)量濃度分別為0.40 mg/mL、0.24 mg/mL)，精密加入含1%HCl的30%乙醇溶液至100 mL，精密稱定，按3.1.2項(xiàng)下方法制得供試溶液，照3.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表1～2。

表1 貝母素甲回收率測(cè)定結(jié)果Tab.1 Recovery test results of verticine

表2 貝母素乙回收率測(cè)定結(jié)果Tab.2 Recovery test results of verticinone

3.3 供試品測(cè)定 取3批供試品，每批平行3份，按3.1.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，照3.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中貝母素甲、貝母素乙測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Contents of verticine and verticinone in tablets(n=3)

4 討論

4.1 文獻(xiàn)關(guān)于浙貝母成分貝母素甲、貝母素乙含有量測(cè)定樣品制備的報(bào)道［4-19］，多采用濃氨試液浸潤(rùn)，再加入三氯甲烷-甲醇 (4∶1)混合溶液提取的方法。實(shí)驗(yàn)亦曾按此法進(jìn)行，但因龍血竭、薏苡仁等成分干擾，提取液中有黏液狀團(tuán)塊出現(xiàn)，抽濾、離心較困難，所得樣品測(cè)定結(jié)果平行性不佳。本實(shí)驗(yàn)采用低濃度酸醇提取，氨水堿化后三氯甲烷萃取的方法能制得理想供試品溶液，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。且經(jīng)對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)處理方法與本實(shí)驗(yàn)所采用的提取方法，無(wú)論貝母藥材或本制劑，2種方法貝母素甲和貝母素乙的含量測(cè)定結(jié)果一致。本方法不僅可用于本制劑，也可作為浙貝母藥材生物堿提取處理的新方法。

4.2 實(shí)驗(yàn)中采用乙腈-0.06%二乙胺溶液 (70∶30)為流動(dòng)相，在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，二乙胺在作為改性劑應(yīng)用時(shí)蒸餾后使用為佳，直接使用或用量較大時(shí)基線容易出現(xiàn)較大的波動(dòng)。

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