尹愛(ài)武， 田 潤(rùn)， 陳文衡， 陳 婷

(1.湖南科技學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州425100;2.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲412012)

葛根芩連湯出自《傷寒論》，由葛根30 g、黃連5 g、黃芩20 g、炙甘草5 g組成。原方用來(lái)治療里熱挾表邪下痢之證，有解表清里，升清止痢之功［1］。

微量元素是中藥有效成分的重要組成部分［2］。一些微量元素離子在機(jī)體生物大分子，如核酸、蛋白質(zhì)和激素等功能的表達(dá)中具有重要意義［3-4］。近年來(lái)，研究成果表明，中藥對(duì)于微量元素缺乏性疾病具有治療調(diào)節(jié)作用［5-6］。中藥復(fù)方是中華醫(yī)學(xué)的重要特色，各中藥協(xié)同作用，配伍后較單味藥材具有更好療效。因各中藥微量元素含有量不同，組成復(fù)方后，微量元素的組成將發(fā)生變化。目前對(duì)中藥復(fù)方微量元素的研究較少。因此，加強(qiáng)中藥復(fù)方微量元素的研究，有利于探討復(fù)方對(duì)疾病的治療機(jī)制，促進(jìn)中醫(yī)藥的發(fā)展。目前，中藥中微量元素的分析方法主要有紫外-可見(jiàn)分光光度法［7-8］、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法［9-11］、電感耦合等離子體質(zhì)譜法［12］、原子吸收光譜法［13］、原子熒光光度法［14-15］等。葛根芩連湯是中醫(yī)臨床常用方劑之一。為進(jìn)一步揭示本方的作用機(jī)制，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 (ICP-AES)同時(shí)測(cè)定Ca，Mg，Zn，F(xiàn)e，Mn，Cu，Sr，Co，Ni，Cd 和 Pb 等元素的含有量。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 受試藥物 葛根、黃芩、黃連、甘草購(gòu)于廣州清平藥材大市場(chǎng)，藥材符合2010年版《中國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。將各種藥材洗凈，用蒸餾水沖洗3次，晾干，置105℃烘干，粉碎，置于碾缽內(nèi)，碾成粉末狀，置干燥器內(nèi)備用。

1.2 試劑 Ca，Mg，Zn，F(xiàn)e，Mn，Cu，Sr，Co，Ni，Cd和Pb離子液體標(biāo)樣 (質(zhì)量濃度1 000 μg/mL，購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)。硝酸、高氯酸均為分析純，去離子水。

1.3 儀器 ICPQ-1000型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀 (日本，島津公司)，Sartorius電子天平，Milli-Q型水純化系統(tǒng) (Millpore)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試樣品的制備

2.1.1 各單味生藥樣品 分別準(zhǔn)確稱取葛根、黃芩、黃連、甘草藥材各6份，每份1.000 0 g于50 mL錐形瓶中，以待消化。

2.1.2 葛根芩連湯水煎浸膏 準(zhǔn)確稱取葛根芩連湯藥材3.000 g(按組方比例)，稱取12份，每份加入去離子水24 mL，先浸泡30 min，再各取6份分別加熱回流提取60、90 min，分別濃縮得葛根芩連湯60、90 min煎液浸膏。

2.2 HNO3-HClO4消解 將上述供試樣品分別加入一定量的混酸 (HNO3∶HClO4=4∶1)，在電熱板上低溫加熱約2 h，待黃煙冒盡后，升高溫度加熱至溶液近干，加入少量去離子水繼續(xù)加熱至白煙冒盡，再加入15 mL去離子水，溶解，轉(zhuǎn)移到50 mL量瓶中，用去離子水稀釋至刻度。同時(shí)平行做一份空白試液。在選定的工作條件下，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。

2.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 按方劑配比量準(zhǔn)確稱取葛根芩連湯方劑混合粉末6份，每份3.000 0 g，分別置于100 mL燒杯中，再在各份樣品中準(zhǔn)確加入混合標(biāo)準(zhǔn)液6 mL，然后一起置于電熱板上，用HNO3-HClO4消解后，定容至50 mL，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各元素加樣回收率。

2.4 測(cè)定 采用ICP-AES法測(cè)定，功率1 200 W，載氣體積流量1.0 L/min，溶液提升量1.5 mL/min，長(zhǎng)波段積分時(shí)間為5 s，短波段30 s;各元素測(cè)定波長(zhǎng):Ca 318.0 nm，Mg 283.8 nm，Zn 212.4 nm，F(xiàn)e 259.9 nm，Mn 278.6 nm，Cu 325.9 nm，Sr 407.77 nm，Co 206.2 nm，Ni 221.6 nm，Cd 228.8 nm，Pb 340.5 nm。

2.5 精密度和檢出限 空白溶液采用HNO3-HClO4消解法消解后，用ICP-AES法測(cè)定空白溶液10次，取其結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍作為檢測(cè)限。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和各元素的檢測(cè)限，得到待測(cè)元素Ca，Mg，Zn，F(xiàn)e，Mn，Cu，Sr，Co，Ni，Cd，Pb 的檢測(cè) 限 分 別 為，0.035、0.071、0.007、0.272、0.006、 0.009、 0.001、 0.007、 0.008、 0.002、0.020 μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)分別為1.3%、1.6%、1.9%、3.8%、2.1%、2.8%、1.4%、2.4%、2.2%、1.7%、1.6%。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 將各元素的標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制成一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、3.0、6.0、10.0 mg/L，在選定的儀器操作條件下進(jìn)行測(cè)試，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得線性相關(guān)系數(shù)在0.999 37～0.999 96。各元素的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)、線性范圍見(jiàn)表1。

表1 各元素的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)，線性范圍Tab.1 Linear regression equation，correlation coefficient，linear range of every element

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 葛根芩連湯中各元素的加樣回收率見(jiàn)表2。結(jié)果表明各元素的加樣回收率在97.33%～102.92%，RSD＜5%，結(jié)果良好，表明用ICP-AES法測(cè)定葛根芩連湯中微量元素含有量的方法可靠。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取葛根、黃芩、黃連、甘草藥材各6份，按2.2項(xiàng)下消解后，測(cè)定各藥材中元素含有量見(jiàn)表 3，各元素的 RSD為0.39% ～2.95%，表明重復(fù)性好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of reproducibility tests(n=6)

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別準(zhǔn)確稱取葛根、黃芩、黃連、甘草藥材各3.000 g，分別加入去離子水24 mL，先浸泡30 min，再加熱回流提取60 min，減壓濃縮得浸膏。按2.2項(xiàng)下方法消解后，取供試品溶液，分別在0、4、8、12，16、24 h測(cè)定元素含有量，結(jié)果見(jiàn)表4。表明各藥材元素含有量基本不變，各元素的RSD為0.11%～2.96%，表明穩(wěn)定性好。

2.10 樣品分析 先將葛根、黃芩、黃連、甘草藥材及葛根芩連湯60、90 min煎煮液所得浸膏進(jìn)行消解。然后采用ICP-AES法進(jìn)行測(cè)定，各生藥微量元素的含有量結(jié)果見(jiàn)表5，葛根芩連湯煎煮60、90 min時(shí)微量元素的含有量結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.4 Results of stability tests(n=6)

表5 不同中藥中微量元素的測(cè)定(n=6)Tab.5 Contents of trace elements in different herbs(n=6)

表6 不同煎煮時(shí)間葛根芩連湯中微量元素的測(cè)定Tab.6 Contents of trace elements in Gegen Qinlian Decoction in different decoction time(n=6)

3 討論

3.1 消解體系的比較 用以下3種消化體系，即HNO3/HClO4(4∶1);HNO3/H2O2(4∶1);HNO3/HCl(3∶1)對(duì)樣品消化處理，結(jié)果表明，HNO3/HClO4(4∶1)體系消解后，各元素的回收率在96.03 %～104.74%，結(jié)果良好，因此在試驗(yàn)中采用HNO3/HClO4(4∶1)消解體系。

3.2 煎煮時(shí)間對(duì)微量元素析出的影響 從表6可以看出，煎煮60 min時(shí)葛根芩連湯的微量元素基本析出，延長(zhǎng)煎煮時(shí)間幾乎不能增加微量元素的析出?？梢赃M(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究微量元素充分析出的最短時(shí)間及煎煮中微量元素在析出過(guò)程中的相互影響關(guān)系，進(jìn)而從微量元素的角度出發(fā)，探討方劑的最佳煎煮時(shí)間。在復(fù)方煎煮液中沒(méi)有檢測(cè)到Co、Ni、Cd、Pb 4種元素，可能是藥材中這4種元素含有量低及其絡(luò)合物在水中不易溶解。

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