尹愛武， 田 潤， 陳文衡， 陳 婷

(1.湖南科技學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州425100;2.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲412012)

葛根芩連湯出自《傷寒論》，由葛根30 g、黃連5 g、黃芩20 g、炙甘草5 g組成。原方用來治療里熱挾表邪下痢之證，有解表清里，升清止痢之功［1］。

微量元素是中藥有效成分的重要組成部分［2］。一些微量元素離子在機(jī)體生物大分子，如核酸、蛋白質(zhì)和激素等功能的表達(dá)中具有重要意義［3-4］。近年來，研究成果表明，中藥對于微量元素缺乏性疾病具有治療調(diào)節(jié)作用［5-6］。中藥復(fù)方是中華醫(yī)學(xué)的重要特色，各中藥協(xié)同作用，配伍后較單味藥材具有更好療效。因各中藥微量元素含有量不同，組成復(fù)方后，微量元素的組成將發(fā)生變化。目前對中藥復(fù)方微量元素的研究較少。因此，加強(qiáng)中藥復(fù)方微量元素的研究，有利于探討復(fù)方對疾病的治療機(jī)制，促進(jìn)中醫(yī)藥的發(fā)展。目前，中藥中微量元素的分析方法主要有紫外-可見分光光度法［7-8］、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法［9-11］、電感耦合等離子體質(zhì)譜法［12］、原子吸收光譜法［13］、原子熒光光度法［14-15］等。葛根芩連湯是中醫(yī)臨床常用方劑之一。為進(jìn)一步揭示本方的作用機(jī)制，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 (ICP-AES)同時測定Ca，Mg，Zn，F(xiàn)e，Mn，Cu，Sr，Co，Ni，Cd 和 Pb 等元素的含有量。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 受試藥物 葛根、黃芩、黃連、甘草購于廣州清平藥材大市場，藥材符合2010年版《中國藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。將各種藥材洗凈，用蒸餾水沖洗3次，晾干，置105℃烘干，粉碎，置于碾缽內(nèi)，碾成粉末狀，置干燥器內(nèi)備用。

1.2 試劑 Ca，Mg，Zn，F(xiàn)e，Mn，Cu，Sr，Co，Ni，Cd和Pb離子液體標(biāo)樣 (質(zhì)量濃度1 000 μg/mL，購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)。硝酸、高氯酸均為分析純，去離子水。

1.3 儀器 ICPQ-1000型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀 (日本，島津公司)，Sartorius電子天平，Milli-Q型水純化系統(tǒng) (Millpore)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試樣品的制備

2.1.1 各單味生藥樣品 分別準(zhǔn)確稱取葛根、黃芩、黃連、甘草藥材各6份，每份1.000 0 g于50 mL錐形瓶中，以待消化。

2.1.2 葛根芩連湯水煎浸膏 準(zhǔn)確稱取葛根芩連湯藥材3.000 g(按組方比例)，稱取12份，每份加入去離子水24 mL，先浸泡30 min，再各取6份分別加熱回流提取60、90 min，分別濃縮得葛根芩連湯60、90 min煎液浸膏。

2.2 HNO3-HClO4消解 將上述供試樣品分別加入一定量的混酸 (HNO3∶HClO4=4∶1)，在電熱板上低溫加熱約2 h，待黃煙冒盡后，升高溫度加熱至溶液近干，加入少量去離子水繼續(xù)加熱至白煙冒盡，再加入15 mL去離子水，溶解，轉(zhuǎn)移到50 mL量瓶中，用去離子水稀釋至刻度。同時平行做一份空白試液。在選定的工作條件下，對樣品進(jìn)行測定。

2.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 按方劑配比量準(zhǔn)確稱取葛根芩連湯方劑混合粉末6份，每份3.000 0 g，分別置于100 mL燒杯中，再在各份樣品中準(zhǔn)確加入混合標(biāo)準(zhǔn)液6 mL，然后一起置于電熱板上，用HNO3-HClO4消解后，定容至50 mL，對樣品進(jìn)行測定，計(jì)算各元素加樣回收率。

2.4 測定 采用ICP-AES法測定，功率1 200 W，載氣體積流量1.0 L/min，溶液提升量1.5 mL/min，長波段積分時間為5 s，短波段30 s;各元素測定波長:Ca 318.0 nm，Mg 283.8 nm，Zn 212.4 nm，F(xiàn)e 259.9 nm，Mn 278.6 nm，Cu 325.9 nm，Sr 407.77 nm，Co 206.2 nm，Ni 221.6 nm，Cd 228.8 nm，Pb 340.5 nm。

2.5 精密度和檢出限 空白溶液采用HNO3-HClO4消解法消解后，用ICP-AES法測定空白溶液10次，取其結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍作為檢測限。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和各元素的檢測限，得到待測元素Ca，Mg，Zn，F(xiàn)e，Mn，Cu，Sr，Co，Ni，Cd，Pb 的檢測 限 分 別 為，0.035、0.071、0.007、0.272、0.006、 0.009、 0.001、 0.007、 0.008、 0.002、0.020 μg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)分別為1.3%、1.6%、1.9%、3.8%、2.1%、2.8%、1.4%、2.4%、2.2%、1.7%、1.6%。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 將各元素的標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制成一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、3.0、6.0、10.0 mg/L，在選定的儀器操作條件下進(jìn)行測試，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得線性相關(guān)系數(shù)在0.999 37～0.999 96。各元素的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表1。

表1 各元素的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)，線性范圍Tab.1 Linear regression equation，correlation coefficient，linear range of every element

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 葛根芩連湯中各元素的加樣回收率見表2。結(jié)果表明各元素的加樣回收率在97.33%～102.92%，RSD＜5%，結(jié)果良好，表明用ICP-AES法測定葛根芩連湯中微量元素含有量的方法可靠。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取葛根、黃芩、黃連、甘草藥材各6份，按2.2項(xiàng)下消解后，測定各藥材中元素含有量見表 3，各元素的 RSD為0.39% ～2.95%，表明重復(fù)性好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of reproducibility tests(n=6)

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別準(zhǔn)確稱取葛根、黃芩、黃連、甘草藥材各3.000 g，分別加入去離子水24 mL，先浸泡30 min，再加熱回流提取60 min，減壓濃縮得浸膏。按2.2項(xiàng)下方法消解后，取供試品溶液，分別在0、4、8、12，16、24 h測定元素含有量，結(jié)果見表4。表明各藥材元素含有量基本不變，各元素的RSD為0.11%～2.96%，表明穩(wěn)定性好。

2.10 樣品分析 先將葛根、黃芩、黃連、甘草藥材及葛根芩連湯60、90 min煎煮液所得浸膏進(jìn)行消解。然后采用ICP-AES法進(jìn)行測定，各生藥微量元素的含有量結(jié)果見表5，葛根芩連湯煎煮60、90 min時微量元素的含有量結(jié)果見表6。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.4 Results of stability tests(n=6)

表5 不同中藥中微量元素的測定(n=6)Tab.5 Contents of trace elements in different herbs(n=6)

表6 不同煎煮時間葛根芩連湯中微量元素的測定Tab.6 Contents of trace elements in Gegen Qinlian Decoction in different decoction time(n=6)

3 討論

3.1 消解體系的比較 用以下3種消化體系，即HNO3/HClO4(4∶1);HNO3/H2O2(4∶1);HNO3/HCl(3∶1)對樣品消化處理，結(jié)果表明，HNO3/HClO4(4∶1)體系消解后，各元素的回收率在96.03 %～104.74%，結(jié)果良好，因此在試驗(yàn)中采用HNO3/HClO4(4∶1)消解體系。

3.2 煎煮時間對微量元素析出的影響 從表6可以看出，煎煮60 min時葛根芩連湯的微量元素基本析出，延長煎煮時間幾乎不能增加微量元素的析出。可以進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究微量元素充分析出的最短時間及煎煮中微量元素在析出過程中的相互影響關(guān)系，進(jìn)而從微量元素的角度出發(fā)，探討方劑的最佳煎煮時間。在復(fù)方煎煮液中沒有檢測到Co、Ni、Cd、Pb 4種元素，可能是藥材中這4種元素含有量低及其絡(luò)合物在水中不易溶解。

［1］余林中，伍杰勇，羅佳波，等.葛根芩連湯配伍與解熱藥效關(guān)系研究［J］.中國中藥雜志，2004，29(7):663-667.

［2］孫 輝，趙成愛，周正輝.落地生根中微量元素鋅的含量及醫(yī)學(xué)應(yīng)用［J］.世界元素醫(yī)學(xué)，2009，16(4):25-28.

［3］孫各琴，鄧守恒.高硒情況下維生素E對老齡大鼠血清中抗氧化作用的影響［J］.廣東微量元素科學(xué)，2002，9(1):16-19.

［4］張勝幫，郭玉生.ICP-AES法測定酸棗仁湯中多種金屬元素［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2004，24(12):1663-1665.

［5］李清亞，張 松，祝 揚(yáng)，等.中藥與微量元素聯(lián)合應(yīng)用治療冠心病的效果觀察［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，16(25):3620-3621.

［6］周燕青，魏執(zhí)真，趙 霖.心律失?；颊呶⒘吭刈兓罢{(diào)脈湯對其影響的臨床研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2002，9(1):3-4.

［7］曾 亮，劉 慧，王克琴，等.分光光度法測定苦參中微量元素銅的含量［J］.武漢生物工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，2(4):192-194.

［8］徐 暄.紫外分光光度法測定櫻桃番茄中微量元素硒［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(22):10356，10397.

［9］張勝幫，郭玉生.ICP-AES法測定酸棗仁湯中多種金屬元素［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2004，24(12):1663-1165.

［10］王繼永，王元忠，曾 燕，等.抗癌新藥金蕎麥中微量元素的光譜測定［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2011，31(1):253-255.

［11］周 婭，楊定清，謝永紅，等.ICP-AES測定趕黃草中的微量元素［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28(2):563-565.

［12］王桂花，張 瑤，楊 屹，等.ICP-MS用于枳殼中五種重金屬元素溶出特性的研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2011，319(3):820-822.

［13］關(guān) 明，翁灼斌，熊敏波，等.原子吸收光譜法測定新疆不同居群大蒜中微量元素的含量［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2011，31(3):827-832.

［14］賴紅芳，黃秀香，韋瑞松.微波消解氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定扶芳藤中汞的含量［J］.應(yīng)用化工，2008，37(9):1094-1096.

［15］陳 偉，趙玉英，董建國，等.葵花粕與葵花籽中微量元素含量的測定［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，26(3):271-273.