鄭 林， 龐秀清， 蘭燕宇， 李勇軍， 王永林， 黃 勇*

(1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550004;2.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550004)

參芎葡萄糖注射液由丹參和鹽酸川芎嗪配伍組成，具有抗血小板聚集，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈作用，臨床用于閉塞性腦血管病及其它缺血性血管疾病的治療［1-3］。參芎葡萄糖注射液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (WS-10001-(HD-1136)-2002)的含量測(cè)定項(xiàng)目只對(duì)丹參素和鹽酸川芎嗪進(jìn)行定量控制［4］，難以全面反映制劑的化學(xué)成分特征。隨著我國(guó)藥品生產(chǎn)質(zhì)量控制水平的提高和對(duì)注射劑安全、療效、質(zhì)量可控等問(wèn)題重視程度的不斷深入，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局相繼提出了“國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高行動(dòng)計(jì)劃”和“中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)工作”［5-7］，以全面提升藥品質(zhì)量控制水平。本研究基于參芎葡萄糖注射液UPLC-Q-TOF質(zhì)譜定性分析和組成該注射液復(fù)方的藥味丹參的化學(xué)成分［8-10］，最終確定了參芎葡萄糖注射液中6種主要化學(xué)成分，并建立了UFLC同時(shí)測(cè)定該6種成分的方法，為參芎葡萄糖注射液的質(zhì)量控制與綜合評(píng)價(jià)提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

超快速液相色譜系統(tǒng) (UFLC，島津，包括二元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Lcsolution工作站);AE2401/10萬(wàn)電子天平 (梅特勒－托利多儀器上海有限公司);超純水機(jī) (四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)。

乙腈 (德國(guó)MERCK公司)為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純。丹參素鈉 (批號(hào)110855200508)，鹽酸川芎嗪 (批號(hào) 110817-200305)，原兒茶醛 (批號(hào)110810-200705)對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;迷迭香酸 (批號(hào) MUST-10120901)，丹酚酸 B(批號(hào) MUST-11031401)，丹酚酸A(批號(hào)MUST-10012901)對(duì)照品購(gòu)于北京恒元啟天化工技術(shù)研究院;參芎葡萄糖注射液 (貴州景峰注射劑有限公司提供)。

2 方法與結(jié)果［11-12］

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相乙腈 (A)-0.05%磷酸(B)，體積流量1 mL/min，梯度洗脫，0～7 min，A 2% ～4%;7～12 min，A 4% ～18%;12～15 min，A 18% ～20%;15～22 min，A 20% ～23%;22～32 min，A 23% ～32%;32～42 min，A 32%～35%;42～50 min，A 35% ～90%。柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取丹參素鈉、鹽酸川芎嗪、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A適量，分別置于6個(gè)10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為1.056、7.649、1.084、1.020、1.046、1.036 mg/mL的對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述6種對(duì)照品貯備液8、6、2、1.2、1.2、1.2 mL置同一個(gè)20 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 精密量取本品10 mL，加5%葡萄糖溶液稀釋?zhuān)ㄈ葜?5 mL，搖勻即可。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品混合溶液和供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果6種被測(cè)成分分離良好，在供試品溶液色譜中與其他物質(zhì)色譜峰分離度均大于1.5(見(jiàn)圖1)。同時(shí)供試品中被測(cè)定化合物色譜圖與對(duì)照品色譜圖比較，供試品中被測(cè)定的6個(gè)化合物的紫外光譜圖與各自對(duì)照品的紫外光譜圖一致，且經(jīng)不同流動(dòng)相系統(tǒng)考察，6個(gè)被測(cè)成分的保留時(shí)間分別與對(duì)照品的保留時(shí)間一致，說(shuō)明該方法具有良好的專(zhuān)屬性。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品貯備液0.25、0.5、1、2、4、8 mL分別置于6個(gè) 10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，按擬定的色譜條件注入U(xiǎn)FLC測(cè)定，以峰面積對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量進(jìn)行線性回歸，得各被測(cè)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，見(jiàn)表1。

圖1 對(duì)照品 (A)和樣品 (B)的UFLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果6個(gè)被測(cè)定成分峰面積平均值的RSD分別為0.45%、0.69%、1.87%、0.61%、1.12%、1.17%，表明儀器的精密度良好。

表1 6個(gè)被測(cè)成分的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of six components

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果6個(gè)被測(cè)定成分質(zhì)量濃度的RSD值分別為0.46%、0.40%、1.40%、0.81%、1.71%、2.34%。

2.8 中間精密度試驗(yàn) 以不同時(shí)間，不同實(shí)驗(yàn)人員取與重復(fù)性試驗(yàn)同一批號(hào)的供試品6份，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果與重復(fù)性結(jié)果進(jìn)行比較，顯示精密度良好，RSD值分別為 0.55%、1.26%、2.19%、0.22%、0.36%、0.68%。

2.9 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果6個(gè)被測(cè)定成分峰面積平均值的RSD分別為0.97%、0.93%、2.60%、0.81%、1.16%、2.17%表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗(yàn) 精密量取同一批號(hào)的參芎葡萄糖注射液5 mL共6份，分別置25 mL量瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.11 樣品測(cè)定與結(jié)果分析 取不同批次的參芎葡萄糖注射液，每個(gè)樣品平行做2份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件進(jìn)行6種成分的分析，用當(dāng)天隨行的對(duì)照品溶液進(jìn)行計(jì)算，測(cè)得6種成分的質(zhì)量濃度結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 用二極管陣列檢測(cè)器分別對(duì)6種成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描得知，丹參素、鹽酸川芎嗪、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的最大吸收波長(zhǎng)分別為220，217，230，220，221，221 nm，為兼顧各組分的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和檢測(cè)靈敏度，選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果 (n=6)Tab.2 Determination results of recovery tests(n=6)

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=2)Tab.3 Determination results of samples(n=2)

3.2 曾對(duì)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.5%乙酸等不同配比流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察，經(jīng)等度或梯度試驗(yàn)比較，結(jié)果表明，以乙腈-0.05%磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫分離效果較好，所檢測(cè)的6個(gè)成分色譜峰既能達(dá)到基線分離，又縮短了分析時(shí)間。

3.3 本實(shí)驗(yàn)首次研究建立了UFLC法同時(shí)測(cè)定參芎葡萄糖注射液中6種活性成分的方法，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，通過(guò)多指標(biāo)成分的定量控制，能夠綜合反映制劑的內(nèi)在質(zhì)量，可用于參芎葡萄糖注射液的質(zhì)量控制。

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