趙偉國， 李運景， 黃 民

(1.中山大學藥學院，廣東廣州510006;2.中山大學附屬中山醫(yī)院，廣東中山528403)

痛經(jīng)康口服液是元胡、當歸、川芎、香附等十二味中藥組成的純中藥復(fù)方制劑，來源于臨床經(jīng)驗方，是中山大學附屬中山醫(yī)院制劑室開發(fā)的新的中藥復(fù)方制劑，具有理氣活血、通絡(luò)止痛的功效，主要用于治療多種原因引起的痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等病癥。前期研究［1］表明本品具有較高的安全性和明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用。為明確本品的抗痛經(jīng)作用及相關(guān)機制，本次研究采用實驗性痛經(jīng)大鼠模型，觀察痛經(jīng)康口服液抗痛經(jīng)作用，并進一步揭示并探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥品及試劑 痛經(jīng)康口服溶液2.9 g生藥/mL及1.45 g生藥/mL(批號:20101108)，中山市人民醫(yī)院自制;己烯雌酚注射液 (批號:100104)，上海通用藥業(yè)股份有限公司;縮宮素注射液 (批號:0911262)，河南輔仁懷慶堂制藥有限公司;市售對照品 (治療對照)田七痛經(jīng)膠囊 (批號:N08009、N11026)，廣州敬修堂 (藥業(yè))股份有限公司;cDNA試劑盒 (Fermentas公司)，Trizol reagent(Invitrogen公司)，三氯甲烷 (純度 ＞99.8%)(美國Sigma公司)，DL2000 DNA Maker(博大泰克)，Agarose LE(MDBio，Inc.西班牙)，TaqDNA聚合酶 (上海申能博彩生物科技有限公司)，EB(廣州威佳科技有限公司)Tris(The Dow Chemical Company)，Na2EDTA·2H2O(MBCHEM)，冰醋酸 (廣州化學試劑廠)，DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)(美國Sigma公司)，催產(chǎn)素受體 (OTR)，加壓素受體(VPR)，β-actin引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 實驗動物 SPF級SD大鼠，60只，雌性，150～170 g，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證明編號0075806。

1.3 實驗儀器 BS—3000A電子天平 (上海友聲衡器有限公司生產(chǎn)，感量0.1 g);臺式離心機(德國Hettich，型號:Mikr020);UV7504型單光束紫外可見分光光度計 (上海欣茂儀器有限公司);低溫高速離心機 (長沙平凡儀器儀表有限公司);CU420型電熱恒溫水箱 (上海一恒科技有限公司);酶標儀 TECAN TYPE:Sunrise Remote/TonchScreen(南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司，DG5033A型);LX—100手掌型離心機(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)，WO—9413B型凝膠成像系統(tǒng) (北京六一儀器廠)，Hema3200基因擴增儀 (珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)，POWER BC數(shù)控電泳儀 (上海申能博彩生物科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 劑量設(shè)計與分組

2.1.1 分組 正常對照組和模型對照組、田七痛經(jīng)膠囊組、痛經(jīng)康高、中、低劑量組，每組10只。

2.1.2 劑量設(shè)計 根據(jù)人服用劑量為50 mL/次(1.45 g生藥/mL)，每天2次，得大鼠每天等效劑量為 ［50 mL×2/60 kg］×6.5=10.83 mL/kg(按每人60 kg體質(zhì)量計算)。痛經(jīng)康低、中、高劑量組為大鼠等效劑量的0.5倍、1倍及2倍，得痛經(jīng)康低、中、高劑量組劑量分別為 7.85、15.70、31.41 g/(kg·d);田七痛經(jīng)膠囊組劑量為2 g/kg。

2.2 造模及給藥［2］除正常對照組外，各組大鼠股部皮下注射己烯雌酚，1次/d，連續(xù)11 d，其中第1天及第11天注射量為0.8 mg/只，第2天至第10天注射量為0.4 mg/只。皮下注射己烯雌酚的同時，正常對照組、模型對照組、田七痛經(jīng)膠囊組、痛經(jīng)康高、中、低劑量組大鼠按照1 mL/100 g灌胃給藥，痛經(jīng)康高、中、低劑量組給予相應(yīng)質(zhì)量濃度的痛經(jīng)康口服溶液，田七痛經(jīng)膠囊組給予0.2 g/mL田七痛經(jīng)膠囊溶液，劑量為2 g/(kg·d)，正常對照組及模型對照組給予等量的生理鹽水，連續(xù)給藥11 d。于最后1次給藥40 min后，所有大鼠按體質(zhì)量4 U/kg腹腔注射縮宮素致大鼠扭體反應(yīng)。

2.3 觀察及指標檢測

2.3.1 基本情況觀察 從實驗開始至實驗結(jié)束，每天觀察并記錄大鼠的日常情況1次。給藥第11天，于腹腔注射縮宮素后觀察大鼠扭體反應(yīng)發(fā)生的潛伏期、30 min內(nèi)的扭體反應(yīng)次數(shù)和扭體動物數(shù)。扭體反應(yīng)標準:大鼠腹部收縮內(nèi)凹，軀干與后肢伸展，臀部與一側(cè)肢體內(nèi)旋。體質(zhì)量:實驗開始和實驗結(jié)束各稱大鼠體質(zhì)量1次。

2.3.2 標本采集及檢測 測完扭體反應(yīng)后1 h，按40 mg/kg體質(zhì)量對大鼠進行戊巴比妥鈉麻醉，分離腹主動脈，無菌采血約5 mL，分2份，1份置于肝素抗凝管后離心取血漿-80℃保存，另1份置于無抗凝管中，離心取血清-80℃保存待測。放血處死解剖取子宮組織，分2份，一份置于-80℃保存;另一份子宮組織置于4%多聚甲醛保存待用。

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體見表1。

表1 引物合成序列Tab.1 Primer sequence

取凍存子宮組織100 mg按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的實驗步驟進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取1 μL cDNA依次加 入 10 × buffer 2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、10 μmol/L Primer 0.5 μL，Taq 酶 0.25 μL，ddH2O 19.25 μL，分別進入PCR循環(huán)。循環(huán)條件:95℃預(yù)變性5 min、94℃變性0.5 min，退火 (催產(chǎn)素受體54℃、加壓素受體58.5℃、β-actin 57.2℃)0.5 min，72℃延伸1 min。催產(chǎn)素受體、加壓素受體、β-actin共30個循環(huán)，循環(huán)終末72℃10 min終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物10 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條帶結(jié)果采用凝膠圖像分析儀分析，計算目的產(chǎn)物與β-actin的OD比值，作為表達的半定量指標。

3 結(jié)果

3.1 基本觀察 各個試驗過程中，各給藥大鼠在給藥后被毛光亮，精神活動、大小便等均未見異常，口、眼、耳、鼻均未見異常分泌物。體質(zhì)量:給藥結(jié)束時模型對照組體質(zhì)量較實驗開始時略有減輕，與正常對照組比較明顯減輕 (P＜0.01);其他各給藥組體質(zhì)量均較前增長，田七痛經(jīng)膠囊組與痛經(jīng)康低劑量組體質(zhì)量較模型對照組明顯增長 (P＜0.01)。結(jié)果見表2。

表2 對痛經(jīng)模型大鼠體質(zhì)量的影響 (±s)Tab.2 Comparison of weight in rats(±s)

表2 對痛經(jīng)模型大鼠體質(zhì)量的影響 (±s)Tab.2 Comparison of weight in rats(±s)

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與模型組比較，＊＊P ＜0.01。

/g正常對照組組別 樣本數(shù)劑量/(g·kg-1)實驗開始時體質(zhì)量/g實驗結(jié)束時體質(zhì)量10 - 188.3±5.2 221.8±6.8模型對照組 10 - 186.2±8.7 183.3±15.5##田七痛經(jīng)膠囊組 10 2.0 191.2±5.2 203.0±9.2＊＊痛經(jīng)康低劑量組 9 7.85 190.7±8.2 206.8±10.9＊＊痛經(jīng)康中劑量組 10 15.7 185.2±9.3 190.1±10.5痛經(jīng)康高劑量組10 31.41 186.3±12.0 197.4±13.4

3.2 扭體反應(yīng) 正常對照組10只大鼠未見出現(xiàn)扭體反應(yīng)，其余各給藥組均出現(xiàn)不同程度的扭體反應(yīng)。痛經(jīng)康低、中、高劑量組出現(xiàn)扭體反應(yīng)的動物數(shù)量均較模型對照組減少，且呈劑量依賴關(guān)系。田七痛經(jīng)膠囊組、痛經(jīng)康中、高劑量組出現(xiàn)扭體反應(yīng)潛伏期較模型對照組延長，30 min扭體反應(yīng)次數(shù)較模型對照組減少，其中痛經(jīng)康中劑量組與模型對照組比較扭體反應(yīng)潛伏期明顯延長 (P＜0.01)，但扭體反應(yīng)次數(shù)無統(tǒng)計學差異。結(jié)果見表3。

3.3 子宮組織催產(chǎn)素及加壓素受體mRNA表達與正常組比較，模型對照組痛經(jīng)大鼠子宮催產(chǎn)素及加壓素受體mRNA表達顯著增高 (P＜0.01)，而田七痛經(jīng)膠囊組、痛經(jīng)康低、中、高劑量組可不同程度降低痛經(jīng)大鼠子宮催產(chǎn)素及加壓素受體mRNA表達 (P＜0.01，P＜0.05)。結(jié)果見表4，圖1，圖2。

表3 對大鼠痛經(jīng)模型扭體反應(yīng)的影響 (±s)Tab.3 Comparison of the writhing response in dysmenorrhea model rats(±s)

表3 對大鼠痛經(jīng)模型扭體反應(yīng)的影響 (±s)Tab.3 Comparison of the writhing response in dysmenorrhea model rats(±s)

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與模型組比較，＊＊P＜0.01。

/%正常對照組組別 樣本數(shù) 劑量/(g·kg-1) 扭體潛伏期/min 30 min扭體次數(shù) 扭體動物數(shù)/只 扭體百分率10 - 00模型對照組 10 - 11.26±4.65## 10.23±10.28## 8 80.0##田七痛經(jīng)膠囊組 10 2.0 12.24±5.03 5.88±5.33 8 80.0痛經(jīng)康低劑量組 9 7.85 7.26±1.93 14.25±6.50 7 77.8痛經(jīng)康中劑量組 10 15.7 19.42±6.50＊＊ 4.00±4.47 6 60.0痛經(jīng)康高劑量組10 31.41 14.50±4.32 5.00±5.39 4 40.0

表4 對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織催產(chǎn)素受體及加壓素受體mRNA表達的影響 (±s)Tab.4 The mRNA expression levels of OTR and VPR in the uteruine of dysmenorrhea model rats(±s)

表4 對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織催產(chǎn)素受體及加壓素受體mRNA表達的影響 (±s)Tab.4 The mRNA expression levels of OTR and VPR in the uteruine of dysmenorrhea model rats(±s)

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05。

-actin正常對照組組別 樣本數(shù) 劑量/(g·kg-1)OTR mRNA/β-actin VPR mRNA/β 10 - 0.528±0.144 0.544±0.212模型對照組 10 - 0.798±0.139## 0.923±0.169##田七痛經(jīng)膠囊組 10 2.0 0.648±0.161* 0.720±0.190*痛經(jīng)康低劑量組 9 7.85 0.650±0.161* 0.744±0.181*痛經(jīng)康中劑量組 10 15.7 0.627±0.156* 0.650±0.180＊＊痛經(jīng)康高劑量組 10 31.41 0.641±0.138* 0.678±0.148＊＊

圖1 催產(chǎn)素受體mRNA表達Fig.1 The mRNA expression levels of OTR in the uteruine of dysmenorrhea model rats

圖2 加壓素受體mRNA表達Fig.2 The mRNA expression levels of VPR in the uteruine of dysmenorrhea model rats

4 討論

原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機制尚未完全明確，但有大量研究顯示原發(fā)性痛經(jīng)與多種原因有關(guān)，主要和前列腺素 (PG)有關(guān)［3］，其次催產(chǎn)素與加壓素也是痛經(jīng)發(fā)生兩個重要致病因素。催產(chǎn)素不僅可直接作用于子宮肌細胞，通過細胞內(nèi)生化途徑引起子宮收縮，同時還能激活磷酸肌醇循環(huán)，調(diào)節(jié)局部前列腺素的產(chǎn)生，引起并加重痛經(jīng)［4］。催產(chǎn)素能刺激PGF2α的合成與釋放，PGF2α能增加催產(chǎn)素的釋放而不影響其合成，兩者具有協(xié)同作用，共同導致子宮收縮［5］。催產(chǎn)素作用于平滑肌細胞的催產(chǎn)素受體升高細胞內(nèi)Ca2+，直接刺激其收縮，而催產(chǎn)素與內(nèi)膜催產(chǎn)素受體結(jié)合后，誘導內(nèi)膜上皮細胞產(chǎn)生PGF2α，以旁分泌方式刺激平滑肌收縮［6］。研究表明隨著痛經(jīng)婦女在月經(jīng)早期激素水平的升高，加壓素成為子宮平滑肌的活動增加子宮血流減少的一個重要因素［7］。正常情況下排卵期血漿中血管加壓素水平最高，黃體期下降直至月經(jīng)期。原發(fā)性痛經(jīng)婦女晚黃體期雌激素水平異常升高，所以在月經(jīng)期第一天血管加壓素水平高于正常人2～5倍［8］。痛經(jīng)患者對血管加壓素的敏感性較高，加壓素主要通過作用于子宮加壓素受體，引起子宮肌層及動脈壁平滑肌收縮加強，使子宮血流減少，從而引起子宮局部缺血，疼痛加劇。加壓素也能通過促進前列腺素生成和增加子宮平滑肌對縮宮藥物的敏感性，減少子宮血運而致痛經(jīng)。并且催產(chǎn)素受體和加壓素還具有部分交叉作用［9］。應(yīng)用催產(chǎn)素及加壓素拮抗劑阿托西班及SR 49059［10］時可以緩解痛經(jīng)的癥狀，這都說明催產(chǎn)素及加壓素參與了痛經(jīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示大鼠經(jīng)注射己烯雌酚，催產(chǎn)素及加壓素受體mRNA表達升高，對催產(chǎn)素反應(yīng)敏感性增強。預(yù)防性用藥后產(chǎn)生明顯的抗痛經(jīng)作用，這可能與痛經(jīng)康低、中、高劑量組不同程度降低痛經(jīng)大鼠子宮催產(chǎn)素及加壓素受體mRNA表達，降低對催產(chǎn)素反應(yīng)敏感性有關(guān)。

痛經(jīng)屬中醫(yī)“經(jīng)行腹痛”范疇，主要是由于婦女在行經(jīng)期間受到致病因素的影響，導致沖任郁阻或寒凝經(jīng)脈，使氣血運行不暢，胞宮經(jīng)血流通受阻，以致不通則痛;或沖任、胞宮失于濡養(yǎng)，不榮則痛［11］。有研究表明［12］，原發(fā)性痛經(jīng)的主要中醫(yī)證型為氣滯血瘀證、寒凝血瘀證、肝郁氣滯證、肝腎虧損證、氣血虛弱證等，其中以氣滯血瘀證為最多。氣滯血瘀證因多抑郁，復(fù)傷情志，肝郁則氣滯，氣滯則血滯，以致血海氣機不行，經(jīng)血運行不暢，發(fā)為痛經(jīng)。痛經(jīng)康口服液原方由紅花、桃仁、元胡、當歸、川芎、香附等十二味中藥組成，來源于臨床經(jīng)驗方，具有理氣活血、通絡(luò)止痛的功效，主治中醫(yī)辨證氣滯血瘀之痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等病。方中紅花善通利經(jīng)脈，為血中氣藥［13］994，桃仁為血瘀血閉之專藥［13］1789。二者相須為用活血通經(jīng)、化瘀止痛。元胡能理氣活血、調(diào)經(jīng)止痛，辛散溫通，為活血行氣止痛之良藥［14］803。當歸補血活血，調(diào)經(jīng)止痛，為血中之氣藥［13］879。川芎性善散，又走肝經(jīng)，氣中之血藥［13］222。丹參活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，善治血分，去滯生新，調(diào)經(jīng)順脈［13］482。香附為氣病之總司，女科之主帥［14］890，可疏肝理氣，調(diào)經(jīng)止痛，為調(diào)理沖任氣血之要藥。川楝子主入肝經(jīng)，疏泄肝熱，行氣止痛。本方以紅花、桃仁、元胡為君藥，當歸、川芎、丹參加強活血止痛之效，香附、川楝子加強理氣止痛之效，共為臣藥。佐以白芍、蒲黃、五靈脂，諸藥相合共奏活血通經(jīng)、理氣止痛之效，從而使胞宮氣血運行通暢而達通則不痛之功。

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