李金萍 柴阿麗 孫日飛 李寶聚

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院菜蔬花卉研究所，北京 100081）

根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoron.）引起的十字花科蔬菜病害。1878年由俄國學(xué)者Worolin 發(fā)現(xiàn)其病原，并命名，所有十字花科蔬菜的感病品種都會被這一病原菌侵染，該病最早是在13 世紀(jì)發(fā)現(xiàn)于地中海西岸和歐洲南部。目前，在歐洲、北美和亞洲的日本等地已成為一種主要病害，給十字花科蔬菜生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的威脅，在加拿大等十字花科蔬菜栽培大國，也已成為一種新流行的病害（Hwang et al.，2012），現(xiàn)全世界均有分布，尤以溫帶地區(qū)發(fā)生更為嚴(yán)重。根腫病在中國大部分省、市、自治區(qū)都有分布，特別是近年來，根腫病在我國的東北地區(qū)、西南地區(qū)、長江中上游地區(qū)以及山東青島等地迅速擴(kuò)大，危害十分嚴(yán)重，制約著我國十字花科蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。根腫病一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，經(jīng)過幾十年的不懈努力，在根腫菌分類地位、根腫菌生理小種分化、病原菌檢測技術(shù)、病原菌有效接種技術(shù)、病原菌生活史與生物學(xué)特性、根腫病防治等方面已取得突破性進(jìn)展。近幾年來，根腫病的研究在病原菌檢測、病原菌生物防治技術(shù)、病原菌生活史等方面取得了比較突出的成績。

1 根腫病研究新進(jìn)展

1.1 病原菌分類地位

蕓薹根腫菌（P.brassicae）屬根腫菌目根腫菌綱根腫菌屬。對于根腫菌目的分類地位，目前尚有爭議。Hawksworth 等（1995）將其歸為真菌界粘菌門根腫菌綱，Alexopoulos 和Mims（1979）則將其劃到真菌界鞭毛菌亞門根腫菌綱。目前研究中根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)研究將蕓薹根腫菌劃分到原生界根腫菌門根腫菌綱根腫菌屬（Neuhauser et al.，2011）。

1.2 病原菌生活史與發(fā)生規(guī)律

蕓薹根腫菌是嚴(yán)格的專性寄生菌，其生活史有兩個階段：初侵染階段（根毛侵染），病原菌被限定在感染植物的根毛中；再侵染階段（皮層侵染），病原菌在根和下胚軸的皮層和中柱中繁殖（Hwang et al.，2012）。土壤中休眠孢子變成初級游動孢子到達(dá)根毛表面后，穿過細(xì)胞壁侵入根毛內(nèi)部，這個階段被稱為初侵染階段；病原菌在根毛內(nèi)部形成次生原生質(zhì)團(tuán)，一部分細(xì)胞核裂解形成多核的游動孢子囊，每個游動孢子囊產(chǎn)生4～16 個次游動孢子，侵入主根皮層，這個過程叫做再侵染階段。病原菌在侵入的根部細(xì)胞內(nèi)部形成次級原生質(zhì)團(tuán)與細(xì)胞分化有關(guān)，產(chǎn)生根腫組織（Feng et al.，2012）。

溫度是影響根腫菌初侵染階段的關(guān)鍵因子。溫度為25 ℃時最利于根腫菌的初侵染，10 d就可以觀察到發(fā)病癥狀，在20～30 ℃時14 d 才可以觀察到發(fā)病癥狀，而當(dāng)溫度為10 ℃時28 d仍觀察不到發(fā)病癥狀，低溫不利于根腫病的發(fā)生（Sharmaa et al.，2011）。溫度高于26 ℃時，同樣不利于病原菌的侵染并完成生活史及快速繁殖，阻礙病害的發(fā)展（Gossen et al.，2011）。

1.3 病原菌分子生物學(xué)致病機(jī)理

明確根腫菌的分子生物學(xué)致病機(jī)理，可以為培育新的抗性品種以及其他防治手段提供有力參考。根腫菌是嚴(yán)格的專性寄生菌，不能進(jìn)行純培養(yǎng)，從分子生物學(xué)角度研究其致病機(jī)理存在很大困難。到目前為止，在根腫菌侵染寄主植物組織過程中基因表達(dá)的分子生物學(xué)特征方面的報(bào)道很少。國外進(jìn)行了很多該方面研究，共涉及到100 多個部分cDNA 片段或者是全長片段，但經(jīng)序列比對后同源性都比較低，均沒有取得突破性的進(jìn)展。Feng 等（2010）研究發(fā)現(xiàn)在根腫菌中存在少部分幾個基因與其致病性有關(guān)，這些基因能夠編碼一個絲氨酸蛋白酶（PRO1），該蛋白酶能夠刺激根腫菌休眠孢子萌發(fā)。PRO1 是一個單拷貝的基因編碼的蛋白酶，廣泛存在于根腫菌的致病型中。

1.4 病原菌診斷與檢測技術(shù)

目前，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的十字花科蔬菜根腫病檢測技術(shù)迅速發(fā)展，由普通PCR 及巢式PCR 的定性檢測發(fā)展到了熒光定量PCR 的定量檢測，并且將定量檢測與全細(xì)胞脂肪酸技術(shù)相結(jié)合，利用根腫菌侵染后產(chǎn)生的特異性脂肪酸（花生四烯酸20∶4）可以對土壤及植物組織中的根腫菌進(jìn)行精確的定量檢測（Sundelin et al.，2010）。同時，也可以應(yīng)用熒光定量PCR 檢測技術(shù)對粘附帶菌交叉污染的種子、塊莖等進(jìn)行定量檢測，對其帶菌量進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估（Rennie et al.，2011）。采用Tapman 探針與熒光定量PCR 技術(shù)相結(jié)合對田間發(fā)病的土壤及人工接種的帶菌土壤進(jìn)行檢測，該體系的擴(kuò)增效率在92%以上，其檢測的最低限點(diǎn)可以達(dá)到每克土壤500 個休眠孢子，利用人工接種與定量檢測相結(jié)合的方法，可以根據(jù)土壤的帶菌量對田塊的病情進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測，為種植抗病品種及輪作等防治手段提供理論依據(jù)（Wallenhammar et al.，2012）。因此，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的分子生物診斷及檢測技術(shù)已成為根腫菌研究及根腫病防治方面的有力工具，只是在不同的研究中要不斷地調(diào)整引物的特異性以及反應(yīng)程序。

1.5 根腫病生物防治

十字花科蔬菜根腫病防治采取的主要手段有選育抗病品種、化學(xué)防治、土壤消毒、輪作以及生物防治等，但是一直缺乏有效的化學(xué)藥劑，對于田間大面積發(fā)生根腫病的土壤進(jìn)行消毒也是不切實(shí)際的做法。目前，有商品化的抗性品種，但是這些抗性品種的持久性未知，并且根腫菌存在明顯的生理分化，抗性品種也具有很強(qiáng)的小種?；裕?dāng)生理小種發(fā)生變異時，品種將喪失抗性。目前，有一些生防效果較好的生防物質(zhì)及生防菌存在，生防菌主要有莖點(diǎn)霉屬真菌Phoma glomerata、枝頂孢屬真菌Acremonium alternatum以及大白菜根部的一種內(nèi)生真菌Heteroconium chaetospira（Grove）M.B.Ellis，一種酚類物質(zhì)—龍膽酸對根腫病也有一定的防效。由于十字花科蔬菜根腫病病原菌具有很強(qiáng)的抗逆性，在土壤中存活時間長，因此，采用土壤中的生防菌對其進(jìn)行防治成為目前研究的熱點(diǎn)，并且也為根腫病的防治提供了新的思路。研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisQST713）對根腫病有很好的防效，可以達(dá)到60%以上（Lahlali et al.，2011）。同時，在我國從大白菜根際周圍土壤中分離得到 1 株鏈霉菌中的灰紅鏈霉菌（Streptomyces griseorube）可以有效的控制根腫病，在溫室條件下防效可以達(dá)到72.8%，在大田條件下防效可以達(dá)到68.5%（Wang et al.，2012）。粘帚霉在防治根腫病方面也有很好的效果（Peng et al.，2011），并且枯草芽孢桿菌以及粘帚霉等生防菌已經(jīng)有商品化產(chǎn)品存在，為根腫病的田間控制提供了新的鍥機(jī)。

2 展望

2.1 我國根腫菌生活史研究趨勢及展望

從根腫菌生活史的研究歷程來看，國外研究起步較早，在明確根腫菌生活史的基礎(chǔ)上，部分實(shí)驗(yàn)室甚至通過雙重培養(yǎng)技術(shù)以及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以觀察到整個根腫菌在根部侵染的過程以及整個生活史的完成過程。我國在根腫菌生活史研究方面尚處于起步階段，還沒有系統(tǒng)的報(bào)道。我國幅員廣闊，氣候條件差異大，根腫菌的生活史是否與國外一致尚不清楚。生活史不明的同時也阻礙了致病機(jī)理方面的研究進(jìn)程。因此，可以先考慮研究清楚我國分布的根腫菌生活史，在此基礎(chǔ)上對各個階段機(jī)理及腫根的形成過程中植物機(jī)體的代謝途徑、信號傳導(dǎo)以及次生物質(zhì)的產(chǎn)生等進(jìn)行細(xì)化研究，為十字花科蔬菜根腫病從生活史方面入手進(jìn)行防治提供幫助。

2.2 根腫菌致病機(jī)理深入研究的必要性

近年來，根腫病菌分子檢測技術(shù)發(fā)展很快，利用分子水平對根腫菌的致病機(jī)理進(jìn)行研究已成為一種趨勢，國外的學(xué)者及科研人員在這方面做了很多工作，但只有Feng 等（2010）在這方面取得了一定的成果，在根腫菌中發(fā)現(xiàn)存在單拷貝的基因可以編碼1 個絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶能夠刺激根腫菌休眠孢子的萌發(fā)。至于具體刺激根腫菌休眠孢子萌發(fā)的原因、機(jī)理尚不清楚。在生物化學(xué)以及植物病理學(xué)方面的研究還沒有明確根腫菌的致病機(jī)理，只是推測根腫菌侵染過程中腫根的形成是由于根腫菌侵染植物組織后刺激植物組織產(chǎn)生細(xì)胞生長激素以及細(xì)胞分裂素，但具體機(jī)理不清楚。致病機(jī)理是制定防治策略的依托，根腫菌致病機(jī)理的深入研究及細(xì)化對于根腫病控制將是必不可少的。

2.3 病原菌離體培養(yǎng)技術(shù)是未來發(fā)展的一大趨勢

由于根腫菌是寄生于十字花科蔬菜根內(nèi)的專性寄生菌，很難直接得到純培養(yǎng)的單孢菌系，只能從根腫組織通過機(jī)械粉碎過濾離心后獲得根腫菌休眠孢子。采用單孢接種技術(shù)對根腫菌與根毛組織進(jìn)行離體雙重培養(yǎng)以及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)可以對根腫菌進(jìn)行離體培養(yǎng)，但不能獲得大量的腫根，直接影響了十字花科蔬菜根腫病的研究進(jìn)程（Kageyama & Asano，2009）。在根腫菌的研究過程中接種物不斷地活體培養(yǎng)與繁殖，費(fèi)時、費(fèi)力，浪費(fèi)大量的溫室資源，并且根腫菌是土傳病害，在接種物的培養(yǎng)基繁殖過程中很容易造成病害的傳播及大面積蔓延。

同時，根腫菌存在明顯的生理分化，生理小種鑒定是十字花科蔬菜根腫病抗病育種的基礎(chǔ)，而直接得到純培養(yǎng)的單孢菌系又是生理小種準(zhǔn)確劃分的基石，雖然在根腫菌生理小種鑒定時可以采用單孢接種技術(shù)，但單孢接種發(fā)病率低，需要多代培養(yǎng)觀察，費(fèi)時、費(fèi)力。根腫菌純培養(yǎng)技術(shù)將是未來發(fā)展的一大趨勢，如何科學(xué)地對根腫菌進(jìn)行離體培養(yǎng)是當(dāng)前迫切需要解決的關(guān)鍵問題，建立實(shí)用科學(xué)的根腫菌離體培養(yǎng)方法，仍然是國內(nèi)植物病理學(xué)研究的重要問題，只有這樣才能提高十字花科根腫菌致病機(jī)理、生理小種鑒定以及作物抗病品種選育效率，最終實(shí)現(xiàn)對根腫病的持續(xù)控制。

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