劉功良，陶嫦立，白衛(wèi)東 *，趙文紅，王姣姣

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.廣東藥學院 生命科學與制藥學院，廣東 廣州 510006）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）可由氫氰酸、尿素、瓜氨酸、N-氨甲酰基復合物（氨甲酰磷酸鹽）等前體物質(zhì)與乙醇反應得來，此反應可在食品在發(fā)酵和貯藏的過程中自發(fā)進行[1-2]。EC在腐乳、面包、酸奶、奶酪、醬油、醋和酒精飲料等發(fā)酵食品中都被檢出[3-4]，其質(zhì)量濃度變化范圍為ng/L（或ng/kg）至mg/L[5-6]。

EC對人體具有潛在的致癌性，可從腸道和皮膚被快速吸收，吸收程度接近100%[7]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署已將氨基甲酸乙酯劃列為2A類的致癌物[8-9]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會規(guī)定EC的基準劑量可信限的下限值為每天0.3mg/kg從面包、發(fā)酵乳制品和醬油中EC的平均攝入量每天不超過15ng/kg；包括酒精飲料在內(nèi)，EC的平均攝入量每天不超過80ng/kg[6]。

由于氨基甲酸乙酯的危害作用及其在發(fā)酵食品中廣泛存在，檢測發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的含量對食品安全以及人體健康具有重要意義。文章對發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯檢測的預處理，檢測方法的種類及優(yōu)缺點進行綜述。

1 樣品預處理方法

發(fā)酵食品中營養(yǎng)豐富，基質(zhì)種類眾多，很容易對檢測結(jié)果造成干擾，因此，在采用儀器分析方法檢測EC的含量之前，通常需要對發(fā)酵食品進行預處理，將其所含的EC提取出來，盡可能分離純化。常用的預處理方法主要有液/液萃取、固相萃取、固相微萃取和頂空固相微萃取等。

1.1 液/液萃取

現(xiàn)有標準測定方法，如進出口商品檢驗標準“出口酒類中氨基甲酸乙酯殘留量檢驗方法”（SN0285-1993）中采用的即為溶劑萃取法（LLE），該預處理方法過程比較復雜，操作繁瑣，所需時間也較長，無法實現(xiàn)自動化分析，且色素等雜質(zhì)會影響實驗結(jié)果，不能滿足目前的快速準確分析檢測需要[4，10]。

1.2 固相萃取

國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）、美國官方分析化學師協(xié)會（AOAC）和歐盟（EU）推薦的飲料酒中EC的標準檢測方法，均采用固相萃?。⊿PE）作為預處理方法。與液液萃取相比，SPE方法具有速度較快、成本低、回收率高等優(yōu)點，但操作較煩瑣，樣品預處理需1h左右，在產(chǎn)品規(guī)?；瘷z測時速度較慢，且需用使用一定危害的有機溶劑，不利于分析人員的身體健康[11-12]。

1.3 頂空固相微萃取

頂空固相微萃?。℉S-SPME）是最近被采用的預處理方法之一，該方法不需要人工預濃縮，樣品預處理能在5min內(nèi)完成，自動便捷、快速高效，適合規(guī)?；瘻y定，且無需有機溶劑，安全環(huán)保。SPME和氣相色譜聯(lián)用，再與高靈敏度的檢測器如質(zhì)譜、電子捕獲檢測器、原子發(fā)射光譜檢測器結(jié)合，可使檢出限達到μg/L～ng/L的級別。多次頂空固相微萃?。∕HS-SPME）能夠克服通常存在于SPME分析中的基質(zhì)干擾效應，尤其適合于大量不同基質(zhì)的樣品分析[13-14]。

2 氨基甲酸乙酯的檢測方法

發(fā)酵食品經(jīng)過預處理后，通常采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測氨基甲酸乙酯的含量，除此之外，還有高效液相色譜法、傅里葉變換紅外光譜檢測法、核磁共振分光檢定法、時間分辨熒光免疫分析法等。

2.1 氣相色譜法

王立媛等[15]建立了一種同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法用于腐乳中氨基甲酸乙酯含量，該方法的加標回收率在89%～99%，相對標準偏差（RSD）小于10%，最低檢測限達到2.0μg/kg，可作為腐乳中氨基甲酸乙酯含量檢測的確證方法。HORIIS等[16]結(jié)合頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，建立并優(yōu)化了一種方法用以檢測酒精飲料中EC的含量，檢測限為6.7μg/L，檢測結(jié)果的相對標準偏差為0.4%～2.0%，回收率為103.6%～107.6%。何碧英等[17]將結(jié)合固相分散萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，建立了一種檢測氨基甲酸乙酯的方法，并定量檢測了葡萄酒、蘋果醋、酸奶、醬油等發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙酯的含量，為發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的危險性評估提供了科學數(shù)據(jù)。張燕等[18]建立了一種固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HSSPME-GC/MS）方法，用以檢測醬油中氨基甲酸乙酯的含量，方法的檢出限（S/N=3）為1.0μg/L，醬油中氨基甲酸乙酯的回收率為70.56%～129.21%，檢測結(jié)果的日內(nèi)相對標準偏差（RSD）為3.69%，日間RSD為8.50%。張雪娜等[13]建立了多次頂空固相微萃取-氣相色譜法（MHS-SPME-GC）用以檢測多種酒精飲料中EC的含量。該方法的檢測線性范圍為0.04mg/L～100mg/L，線性相關系數(shù)為0.9997，檢出限為34μg/L；重復實驗所得相對標準偏差為2.19%；準確度高，加標回收率在90.9%～103.6%。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是檢測發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯含量的常用方法，預處理簡單，成本相對較低，檢測技術較為成熟，應用范圍廣，可作為標準方法進行推廣。

2.2 高效液相色譜法

PARK SK等[19]使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，建立了一種檢測韓國醬油產(chǎn)品中EC含量的方法，當EC的質(zhì)量濃度在10μg/L～100μg/L和0.1μg/L～20μg/L范圍內(nèi)變化時，該方法具有良好的線性關系，加標的平均回收率為（92.2±1.7）%。MADRERA RR等[20]利用高效液相色譜結(jié)合熒光檢測器（HPLC-FLD），建立了一種檢測蘋果類酒精飲料中EC含量的方法，檢測曲線的線性相關系數(shù)超過0.9999，檢測限與定量限值分別為1.64μg/L和3.56μg/L，回收率為94%～98%，檢測結(jié)果的變異系數(shù)不超過5%[20]。YE CW[14]結(jié)合多重頂空固相微萃取與氣相色譜/氮磷檢測器，建立并優(yōu)化了一種檢測不同酒精飲料中EC含量的方法，檢測限為0.034mg/L，線性范圍為0.04mg/L～100mg/L，檢測結(jié)果的RSD為2.19%，線性相關系數(shù)為0.9997。FU M L等[21]使用HPLC-FLD建立了一種檢測中國黃酒中EC含量的方法，檢測結(jié)果的線性相關系數(shù)為0.9990，該方法的檢測限和定量限為73.2μg/L和243.9μg/L，加標回收率為98.30%～101.30%，檢測方法的準確度（RSD）不超過5%。諸葛慶等[22]建立一種反相高效液相色譜法測定黃酒中氨基甲酸乙酯的方法。EC的質(zhì)量濃度在50.0μg/L～250.0μg/L范圍內(nèi)，該方法的平均回收率為92.9%，RSD為4.5%（n=6），檢出限為10μg/L，線性范圍為100μg/L～1500μg/L（R=0.9995），測定結(jié)果與標準氣相色譜-質(zhì)譜法基本相同。

高效液相色譜在檢測EC之前，需要柱前衍生，成本較高，且不如GC-MS法靈敏，因此其應用范圍不如GC-MS廣。

2.3 傅里葉紅外光譜法

LACHENMEIERD W[23]利用偏最小二乘法結(jié)合傅里葉變換近紅外光譜，建立了一種快速檢測核果類酒精飲料中EC含量的方法。除了能檢測樣品中EC的含量之外，傅里葉變換紅外光譜法還能顯示EC的前體物質(zhì)氫氰酸和貯藏過程中EC含量的最大值等相關信息，但在定量檢測方面，該方法的準確度和精確度很低，只能用于篩分分析過程中的半定量檢測。通過使用該方法，60%～70%的樣品可以被鑒定為陰性樣品，剩余的樣品可使用操作復雜、勞動強度高的參照分析方法定量檢測EC的含量。

隨著研究的深入，傅里葉紅外光譜（FTIR）方法的靈敏度和精密度的進一步提高，F(xiàn)TIR方法必將是EC檢測快速、方便的一種檢測方法，但目前，這種快速檢測方法不能滿足發(fā)酵食品中EC限量標準的測定要求。

2.4 核磁共振分光檢測法

MONAKHOVA Y B等[24]利用偏最小二乘回歸結(jié)合核磁共振色譜，建立了一種檢測核果類飲料中EC含量的方法，該方法的靈敏度和特異性均要高于基于近紅外光譜或傅里葉變換紅外光譜建立的篩選技術，其準確度足夠用于定量檢測含0～1mg/L范圍（歐洲委員會推薦）氨基甲酸乙酯的樣品。

與氣相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜方法相比，該方法省時，除了與含有內(nèi)標的緩沖溶液混合之外，該方法甚至無需額外的樣品制備步驟，但該方法所需儀器設備昂貴，維護成本高。

2.5 時間分辨熒光免疫分析方法

徐巖等[25]以氨基甲酸乙酯-牛血清白蛋白作為免疫原獲得多克隆抗體，以氨基甲酸乙酯-卵清蛋白為包被抗原，利用制備的抗氨基甲酸乙酯多克隆抗體，用Eu3+標記的羊抗兔抗體進行示蹤，建立了時間分辨熒光免疫分析方法用以檢測酒類中氨基甲酸乙酯的殘留，該方法的靈敏度為3.26μg/L，平均回收率為92.4%，同一批次內(nèi)和不同批次間檢測的變異系數(shù)分別為3.3%和6.7%，檢測范圍為1μg/mL～20μg/mL。該方法與甲氨、刀豆氨酸等存在一定程度的交叉反應，檢測的特異性有待進一步提高。

3 結(jié)論

氨基甲酸乙酯的傳統(tǒng)檢測方法盡管具有很高的靈敏度和可靠性，但也存在一些缺陷：樣品預處理的程序比較復雜，檢測成本高，時間長，檢測過程只能在具有大型、貴重儀器的專業(yè)實驗室內(nèi)進行，難以適應市場產(chǎn)品的現(xiàn)場抽查、生產(chǎn)企業(yè)的自查及產(chǎn)品進出口快速通關檢測的要求[26]。建立無損傷檢測方法及研發(fā)方便實用的快速檢測試劑盒是發(fā)酵食品中EC含量檢測迫切需要解決的問題[27]。酶聯(lián)免疫吸附檢測具有特異性高、靈敏度高、快速簡單、成本劃算等優(yōu)點[28]，可作為色譜和光譜等分析方法的補充，尤其是其能同時檢測大批量樣品、具有高通量篩選的能力，成為定性篩選和定量分析的工具，顯示出替換傳統(tǒng)儀器分析的應用前景[29]，能為發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯殘留的高通量快速檢測提供簡單有效的途徑。

隨著細胞融合技術、DNA重組技術、單鏈重組抗體技術和噬菌體展示技術等抗體制備技術的飛速發(fā)展，人們開始用基因工程的方法制備基因重組抗體。氨基甲酸乙酯酶聯(lián)免疫檢測技術以其自身的優(yōu)勢和在方法上的不斷完善，必將在氨基甲酸乙酯的快速檢測方面發(fā)揮愈來愈重要的作用。

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