李廷春，楊華應(yīng)

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，合肥 230031）

煙草經(jīng)甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理可以分離得到多種突變體，這些突變體的獲得將為揭示煙草生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律奠定基礎(chǔ)。煙草突變體的篩選已成為許多重要理論問(wèn)題得以解決的前體，而篩選方法是突變體篩選成敗的關(guān)鍵。

干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子之一[1]。煙草在生長(zhǎng)過(guò)程中，特別是從團(tuán)棵期進(jìn)入旺長(zhǎng)期常常遭遇干旱，干旱已經(jīng)成為影響其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的重要因素。利用突變體材料篩選煙草抗旱突變體，不僅可為抗旱基因克隆及功能分析奠定基礎(chǔ)，還對(duì)于進(jìn)一步探索水分脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及應(yīng)答干旱脅迫的分子機(jī)制具有重要的意義。

1 抗干旱突變體的高通量篩選

對(duì)擬南芥突變體的研究表明，每5萬(wàn)株經(jīng)EMS誘變的擬南芥M2代，其基因中的每一個(gè)基因至少有一次發(fā)生突變的機(jī)會(huì)[2]。對(duì)于如此大規(guī)模的突變體篩選工作，尤其對(duì)煙草這種植株較大的植物，建立一種快速、有效的篩選方法是獲得具備優(yōu)良性狀突變體的關(guān)鍵。

煙草抗干旱篩選根據(jù)其處理方式可分為自然干旱和高滲溶液處理模擬干旱，由于自然干旱所需時(shí)間周期長(zhǎng)，個(gè)體差異較難控制，誤差較大，所以采用高滲溶液處理模擬干旱是較為常用的方法。目前，常用于模擬干旱的高滲溶液是PEG6000溶液，PEG6000是一種高分子量的非滲透調(diào)節(jié)劑，對(duì)水分表現(xiàn)出強(qiáng)烈的親和性，由于其對(duì)植物無(wú)毒害的特點(diǎn)，已被廣泛用于模擬干旱逆境條件，進(jìn)行抗旱材料篩選與干旱響應(yīng)機(jī)制的研究[3-7]。根據(jù)PEG6000溶液處理時(shí)期的不同，抗旱篩選主要有：（1）發(fā)芽期抗旱試驗(yàn)，采用PEG6000溶液處理煙草種子，根據(jù)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)篩選抗旱突變體；（2）煙草種子發(fā)芽后，待子葉完全展開(kāi)時(shí)，采用PEG6000溶液處理煙草小苗，根據(jù)植株萎蔫狀態(tài)、生長(zhǎng)量變化篩選抗旱突變體；（3）苗期抗旱試驗(yàn)，待煙草幼苗長(zhǎng)至6～8片葉時(shí)，采用PEG6000溶液處理，根據(jù)葉片生長(zhǎng)狀態(tài)、相關(guān)生理指標(biāo)（相對(duì)含水量、脯氨酸含量等）篩選抗旱突變體。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)芽期抗旱試驗(yàn)受種子活力影響較大，苗期抗旱試驗(yàn)存在周期長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn)，因此，采用25%PEG6000處理發(fā)芽后小苗進(jìn)行抗旱篩選是篩選煙草抗旱突變體較為理想的方法。具體方法如下：精選大小一致、籽粒飽滿(mǎn)、無(wú)破損的種子，采用9 cm濾紙作為載體，種子發(fā)芽后，待子葉完全展開(kāi)時(shí)，加入25%PEG6000的水溶液，連續(xù)培養(yǎng)5 d后，依據(jù)小苗萎蔫、根長(zhǎng)生長(zhǎng)情況篩選抗旱的煙草突變體材料。

2 煙草抗干旱突變體的鑒定

煙草抗干旱是個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，與氣孔蒸騰、根系活力、脯氨酸積累等均存在密切的關(guān)系，植株的抗旱性可通過(guò)田間表型、細(xì)胞組織學(xué)鑒定、生理生化指標(biāo)測(cè)定以及抗旱相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證[8-11]。

2.1 田間表型鑒定

結(jié)合田間和旱棚，對(duì)抗干旱突變體材料進(jìn)行至少2年以上的表型鑒定，包括農(nóng)藝性狀測(cè)量、干物質(zhì)積累測(cè)定和計(jì)產(chǎn)試驗(yàn)等。

2.2 細(xì)胞組織學(xué)鑒定

采用顯微技術(shù)，對(duì)正常、干旱條件下的抗干旱突變體材料葉片組織的氣孔特征進(jìn)行觀察，并對(duì)細(xì)胞組織鑒定。

2.3 生理生化鑒定

通過(guò)測(cè)定干旱條件下，抗干旱突變體材料的抗氧化酶系統(tǒng)、脯氨酸含量、相對(duì)含水量、蒸騰速率、根系活力等生理指標(biāo)，進(jìn)行煙草抗干旱突變體的生理生化鑒定。

2.4 抗旱相關(guān)基因的克隆與分析

采用圖位克隆、TILLING技術(shù)、基因芯片技術(shù)等篩選、克隆抗旱相關(guān)基因，并采用半定量PCR與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，對(duì)干旱條件下煙草抗干旱突變體材料的滲透調(diào)節(jié)基因、抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，以及逆境應(yīng)答信號(hào)因子基因的表達(dá)特性進(jìn)行研究、分析，鑒定煙草突變體的抗旱性。

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