馬曉梅 馬璐婭 (青海大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，青海 西寧 810001)

2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病機制主要為胰島素抵抗(IR)及β細(xì)胞功能受損兩方面，目前認(rèn)為只有IR不足以引發(fā)DM而需同時有β細(xì)胞功能受損，IR為始動因子，β細(xì)胞功能異常為決定因子。近年來的研究認(rèn)為胰島β細(xì)胞是一個氧化應(yīng)激易受損害的器官，與T2DM的β細(xì)胞功能進(jìn)行性減退有關(guān)，高糖毒性及脂毒性在T2DM的發(fā)生發(fā)展過程中均起到重要作用，高糖毒性及脂毒性均與氧化應(yīng)激有關(guān)，高血糖致使活性氧簇ROS增加，大大超過了機體的清除能力，ROS蓄積并導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，可引起β細(xì)胞凋亡及抑制胰島素合成，降低外周組織對胰島素的敏感性，導(dǎo)致DM的發(fā)生。因此，我們測定了T2DM患者胰島素泵強化治療前后DNA氧化損傷標(biāo)志物-8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平，來進(jìn)一步說明氧化應(yīng)激與DM及并發(fā)癥的關(guān)系。

1 氧化應(yīng)激與自由基

氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時，自由基的產(chǎn)生和抗氧化防御之間嚴(yán)重失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。自由基的種類很多，與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的主要為活性氧簇(ROS)，包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫、一氧化氮等，正常情況下，自由基反應(yīng)對于機體防御機制是必要的，自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡。但在病理情況下，體內(nèi)自由基大大增加，同時，機體抗氧化防御能力下降，氧化能力大大超過抗氧化能力而發(fā)生氧化應(yīng)激，從而直接引起生物膜脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性，DNA損傷，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡，組織損傷，疾病發(fā)生。ROS還可作為重要的細(xì)胞內(nèi)信使，活化許多信號傳導(dǎo)通路，間接導(dǎo)致組織和細(xì)胞的損傷。

2 DM發(fā)生氧化應(yīng)激增加

在DM的發(fā)生、發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的主要機制5方面〔1〕：①糖自氧化：葡萄糖自身氧化作用增加，生成烯二醇和二羥基化合物，同時產(chǎn)生大量的ROS。②蛋白質(zhì)的非酶糖化：在非酶促條件下，葡萄糖和蛋白質(zhì)相互作用形成Amadori產(chǎn)物，然后再形成晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)，AGEs通過與其受體(RAGEs)結(jié)合，促進(jìn)ROS形成。此外，AGEs與脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)。③多元醇通路的活性增高：醛糖還原酶多元醇代謝途徑的活化，可降低NADPH/NADP+，增加NADH/NAD+比例，消耗還原性 GSH，從而誘導(dǎo) ROS合成。④蛋白激酶 C(PKC)的活化：高血糖使二酯酰甘油生成增加，激活PKC，進(jìn)而活化細(xì)胞NADPH氧化酶，誘ROS的合成以及隨后的脂質(zhì)過氧化，反之，ROS也活化PKC，從而使ROS的產(chǎn)生進(jìn)一步增加。⑤抗氧化系統(tǒng)清除能力減弱：高血糖可導(dǎo)致抗氧化酶的糖基化，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，明顯消弱了機體清除自由基的能力。

3 8-OHdG

3.1 8-OHdG的產(chǎn)生 8-OHdG是ROS引起DNA氧化損傷的修飾產(chǎn)物之一。1984年 Kasai和 Nishimura首次報道了8-OHdG〔2〕。羥自由基和單線態(tài)氧可以攻擊DNA鏈上的鳥嘌呤堿基使C-8位發(fā)生羥化而生成加合物8-OhdG，8-OHdG是DNA氧化損傷的特異及主要的產(chǎn)物，是公認(rèn)的內(nèi)源性及外源性因素對DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物〔3〕。研究認(rèn)為，組織或體液中的 8-OHdG 是一種反映 DNA 氧化損傷的敏感指標(biāo)〔2，4，5〕。

在正常生理過程中機體產(chǎn)生的自由基也能導(dǎo)致8-OHdG的產(chǎn)生，因此正常機體中也有8-OHdG存在。組織中8-OhdG含量受ROS的水平、組織的氧化還原作用、細(xì)胞的抗氧化防御機制和DNA修復(fù)能力的影響，機體內(nèi)自由基主要來源于細(xì)胞生化反應(yīng)，此外年齡〔6〕、吸煙〔7〕、劇烈的體育運動〔8〕、紫外線照射、環(huán)境污染等〔9〕因素也可誘發(fā)機體產(chǎn)生自由基。其體內(nèi)含量與機體修復(fù)這種損傷的能力不同有關(guān)〔10〕。

8-OHdG為代謝終產(chǎn)物，在體內(nèi)穩(wěn)定存在，且只能通過DNA氧化損傷途徑形成，8-OHdG通過尿排泄，不僅是全身氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物，還是腫瘤、動脈粥樣硬化和 DM的危險因子〔11〕?？赏ㄟ^分析其在組織細(xì)胞核DNA及線粒體DNA中的含量來反映體內(nèi)DNA氧化損傷，體液中8-OHdG水平不受飲食等因素影響，不是細(xì)胞更新結(jié)果。因此，測定機體8-OHdG含量對評估體內(nèi)氧化損傷和修復(fù)程度，氧化應(yīng)激與DNA損傷的相互關(guān)系，研究退行性疾病、衰老機制、癌發(fā)生機制、環(huán)境毒物、慢性炎癥疾病與氧化應(yīng)激的關(guān)系等均有重要意義。

3.2 8-OHdG與DM 目前，氧化應(yīng)激增強被認(rèn)為是DM及其并發(fā)癥的致病因素。研究表明即使在初發(fā)的T2DM患者體內(nèi)也已經(jīng)存在明顯的氧化應(yīng)激，但高血糖增加ROS產(chǎn)物的機制尚未完全明了，有假說線粒體活性氧簇(MROS)是造成DM并發(fā)癥的主要因素。有文獻(xiàn)指出8-OHdG在大鼠線粒體DNA(mtDNA)比肝臟核DNA高16倍〔6〕。非胰島素依賴性DM患者mt DNA 4 977 bp的缺失和肌肉DNA中的8-OHdG含量比正常對照組明顯升高。

正常生理條件下，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS能迅速被機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)清除，但在高血糖狀態(tài)下產(chǎn)生的過量ROS大大超過了機體的清除能力。線粒體是高血糖誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS的主要部位。Fariss等〔12〕提出線粒體衰老學(xué)說，認(rèn)為mtDNA易受到自由基的攻擊，引發(fā)mtDNA的氧化損傷，產(chǎn)生8-OhdG。Kaiko等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)DM鼠成模8 w后，在其生、腎皮質(zhì)和腎乳頭組織的mtDNA中8-OHdG水平是增加的，同時，該實驗還研究了胰島素干預(yù)治療對DM腎臟組織中增加的8-OHdG水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰島素治療后可以很快使DM鼠尿液和腎臟組織中的8-OHdG水平恢復(fù)正常。8-OHdG是評價DM患者mtDNA損傷的標(biāo)志物〔14〕。

氧化應(yīng)激可能是高血糖對胰島β細(xì)胞毒性作用的主要機制〔15〕。胰島β細(xì)胞易受氧化損傷并極易凋亡，線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激毒性是β細(xì)胞凋亡的直接原因〔12〕。Sakuraba等〔16〕研究日本T2DM患者發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激的產(chǎn)物過度表達(dá)可引起胰島細(xì)胞DNA損傷，從而使胰島β細(xì)胞數(shù)量下降。

3.3 8-OHdG與DM并發(fā)癥 Kowluru等〔17〕提出DM并發(fā)癥的統(tǒng)一機制學(xué)說，其核心均是由于高糖環(huán)境作用下線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過多所致。高血糖引起血管內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體的超氧陰離子自由基、羥自由基等生成過多，導(dǎo)致細(xì)胞中氧化應(yīng)激加劇，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致血管收縮、抗血栓能力下降、血栓形成增加及血管基質(zhì)增生，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化等各種DM并發(fā)癥的形成。

Pan等〔18〕以血清8-OHdG為評價氧化應(yīng)激的指標(biāo)探測DM性視網(wǎng)膜病變的氧化應(yīng)激參數(shù)，得到8-OHdG在DM組比正常對照組顯著增高，DM性視網(wǎng)膜病變組比DM組顯著增高的結(jié)果，從而得出氧化應(yīng)激導(dǎo)致DM的發(fā)生，并且是DM性視網(wǎng)膜病變的重要危險因素，血清氧化應(yīng)激產(chǎn)物8-OHdG增加將預(yù)測DM性視網(wǎng)膜病變的結(jié)論。與單純視網(wǎng)膜病變相比，尿8-OHdG在進(jìn)展性視網(wǎng)膜病變組顯著增高〔19〕，尿8-OHdG水平對DM性視網(wǎng)膜病變的早期診斷和治療有很大的幫助〔20〕。

尿8-OHdG增加與DM并發(fā)癥嚴(yán)重程度相一致，Shimoike等〔21〕的研究報道DM腎病有明顯蛋白尿的患者尿8-OHdG明顯高于無蛋白尿的DM患者。Xu等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)，有微量白蛋白尿的DM腎病患者與正常對照組相比，尿8-OhdG水平顯著增加，而有微量白蛋白尿的DM腎病患者與沒有微量白蛋白尿的DM患者相比，24h尿8-OHdG的排泄水平也有顯著差異。Pan等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)DM患者血清8-OHdG較正常人顯著增加，而DM腎病患者血清8-OHdG較沒有血管并發(fā)癥的DM患者也有顯著增加，提示DM患者有較嚴(yán)重的DNA氧化損傷，氧化應(yīng)激的增加與DM有關(guān)，而在并發(fā)腎病的患者更為嚴(yán)重。

氧化應(yīng)激的水平直接影響著大血管病變的程度，氧化應(yīng)激的程度越重則大血管并發(fā)癥越嚴(yán)重。Nishikawa等〔19〕評價尿8-OHdG作為DM大血管并發(fā)癥進(jìn)展的標(biāo)志物的研究中發(fā)現(xiàn)HbA1c升高組比正常組尿8-OHdG高2.5倍;頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)增加組比正常對照組尿8-OHdG高2.3倍;加強胰島素治療組尿8-OHdG明顯低于常規(guī)胰島素治療組。尿8-OHdG水平與T2DM患者的糖化血紅蛋白HbA1c、頸動脈IMT、冠心病的風(fēng)險評分均呈正相關(guān)。

有學(xué)者指出通過線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈能阻止細(xì)胞內(nèi)ROS形成，可以提供一個預(yù)防DM微血管及大血管并發(fā)癥的潛在策略〔19〕。目前，急需檢出動脈粥樣硬化的非侵入性定量指標(biāo)的出現(xiàn)，尿8-OHdG有很高的敏感性，但仍需要進(jìn)一步研究〔19〕。

3.4 8-OHdG檢測方法 目前8-OHdG檢測方法常用的有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，其靈敏度高、重復(fù)性好，可用于分析生物樣品，尤其是尿中DNA和RNA的氧化損傷產(chǎn)物。此法不需分解處理DNA，特異性較強，測定時間短，尿樣預(yù)處理程序簡單，是一種很有應(yīng)用價值的方法，而且在一定范圍內(nèi)有非常好的線性關(guān)系。

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