蒿雨露，孫黔云，李 敏

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025;2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 550007; 3.貴州省人民醫(yī)院呼吸疾病研究所，貴州貴陽 550002)

補體對機體防御和免疫功能有重要的作用，然而其過度激活會造成炎癥和損傷［1］。旁路激活是補體激活的一條重要途徑，很多疾病的發(fā)生與補體的旁路激活密切相關(guān)［2］。激活的補體會對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生作用和影響。內(nèi)皮細胞具有多種重要的分泌調(diào)節(jié)功能，而補體旁路激活對內(nèi)皮細胞纖溶功能影響的研究極少見報道。為進一步探討炎癥相關(guān)病征中補體激活與凝血功能異常的相關(guān)性，本文開展了補體旁路激活對內(nèi)皮細胞纖溶功能影響的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人微血管內(nèi)皮細胞株(HMEC)由本實驗室傳代培養(yǎng)。眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)的分離制備和激活補體旁路的活力單位測定同文獻［3］。健康人混合血清(normal human serum，NHS)由本實驗室健康志愿者獻血制備。滅活人血清(inactivated normal human serum，INHS)為正常人血清56℃處理30 min而得。將NHS與CVF(6.5× 104U·L－1)等體積混合，37℃孵育30 min，獲得補體旁路充分活化的血清。tPA、PAI-1含量測定試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 活化血清對內(nèi)皮細胞分泌tPA、PAI-1的影響 取對數(shù)期生長的HMEC細胞以1×104cells·well－1接種，培養(yǎng)24 h后棄上清，正常對照組加入200 μl正常培養(yǎng)基，刺激組加入60 μl激活血清孵育物，滅活血清組加入與刺激組等量的滅活人血清，均用正常培養(yǎng)基補足至200 μl。37℃分別培養(yǎng)1、6、12、24 h。取上清測定tPA和PAI-1含量。

1.2.2 活化血清對內(nèi)皮細胞纖溶功能影響的分析 以tPA/PAI-1表示HMEC纖溶功能變化。

進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 補體激活對內(nèi)皮細胞分泌tPA、PAI-1的影響 檢測結(jié)果表明，HMEC經(jīng)活化的血清刺激后，tPA、PAI-1的表達與正常對照組相比有不同程度的增加。其中，1 h時，刺激組、正常對照組、滅活血清組tPA含量分別是(3.82±0.86)、(0.21 ±0.36)、(1.78±1.58)μg·L－1，3組的 PAI-1分別為(46.65±18.82)、(16.97±17.24)、(63.17±27.23)μg· L－1。1 h刺激組tPA含量與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而刺激組PAI-1含量在1 h時和正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在6、12、24 h與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 補體激活對內(nèi)皮細胞纖溶功能的影響情況 tPA/PAI-1表明在1 h時間點刺激組內(nèi)皮細胞的纖溶功能明顯上調(diào)，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而在6、12、24 h時間點時，其纖溶功能低于正常對照組。

3 討論

CVF是一種能特異激活血清補體旁路途徑的蛇毒蛋白，其激活補體旁路的產(chǎn)物與生理或病理條件下補體旁路激活的產(chǎn)物完全一致。本工作采用CVF充分活化的血清作用于內(nèi)皮細胞，觀察補體旁路激活對內(nèi)皮細胞纖溶功能的影響。

本文的結(jié)果顯示正常培養(yǎng)的HMEC具有分泌tPA和PAI-1的功能。HMEC經(jīng)活化血清作用后，在早期會出現(xiàn)內(nèi)皮細胞tPA/PAI-1的明顯上調(diào)，表明纖溶功能明顯增強，隨后下調(diào)至低于正常水平。有研究報道人臍靜脈內(nèi)皮細胞經(jīng)補體旁路激活刺激后，纖溶功能下降［4］，與我們的實驗結(jié)果不相吻合。這種差異可能與內(nèi)皮細胞的來源不同有關(guān)，也可能與實驗中檢測時間點的設(shè)置有關(guān)。

補體過度激活與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，諸如敗血癥、多器官功能衰竭等炎癥引發(fā)的病征均伴隨有凝血功能的異常以及廣泛的微血栓生成［5］，提示凝血系統(tǒng)功能異常與炎癥的發(fā)生有關(guān)。本實驗結(jié)果表明補體旁路激活會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞纖溶功能下降，提示在炎癥相關(guān)疾病和病征中，凝血系統(tǒng)功能的異常可能與補體旁路激活所引發(fā)的內(nèi)皮細胞纖溶功能下降有密切關(guān)系。

［1］ Sarma J V，Ward P A.The complement system［J］.Cell Tissue Res，2011，343(1):227－35.

［2］ Harboe M，Mollnes T E.The alternative complement pathway revisited［J］.J Cell Mol Med，2008，12(4):1074－84.

［3］ 孫黔云，葉巧玲，閆銀萍.小鼠血清補體替代途徑溶血活性測定的新方法［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27(11):1619－22.

［3］ Sun Q Y，Ye Q L，Yan Y P.A new method for measurement of the alternative pathway activity of mouse serum complement［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(11):1619－22.

［4］ 桂軍勝，黃守堅，劉 青.眼鏡蛇毒因子引起內(nèi)皮細胞損傷［J］.中國藥理學(xué)通報，2000，16(6):635－8.

［4］ Gui J S，Huang S J，Liu Q.Cobra venom factor induces injury of cultured endothelial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2000，16 (6):635－8.

［5］ Levi M，van der Poll T.Inflammation and coagulation［J］.Crit Care Med，2010，38(2 suppl):S26－34.