李 婛， 季 興， 曾 麗， 李 偉， 楊淑青

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，以分散性脫髓鞘、軸索損傷和炎癥活動為特征［1］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，女性患病率高于男性，而且癥狀還和體內(nèi)雌激素水平變化相關(guān)［2，3］。近年來，有研究顯示，雄激素對 MS具有一定的治療作用［3，4］。星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎性脫髓鞘疾病中明顯活化，在MS和EAE發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5］。本研究采用實驗性自身免疫性脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠模型觀察雄激素對大鼠EAE中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響來探討其中部分作用機制。

1 材料和方法

1．1 試劑 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的烏拉坦，完全弗式佐劑(CFA，Sigma公司提供，含卡介苗5mg/ml)、卡介苗(衛(wèi)生部上海生物制品研究所)、丙酸睪酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司)、免疫試劑中(原裝進口分裝)已稀釋的即用型膠原纖維酸性蛋白 (glialfibrillary acidic protein，GFAP)Ⅰ 抗(2．5ml)，Ⅱ抗為(原裝進口分裝)生物素化羊抗兔IgG 1 支(濃度 1．5mg/ml，稀釋比為 1∶300 ～1∶500)50μl+抗體稀釋液20ml，鏈霉親和素抗生物素蛋白-過氧化酶免復(fù)合物1支(濃度1μmol/L，稀釋比1∶50～1∶200)100μl，DAB 顯色液 5m(均由北京博奧森提供)。

1．2 實驗動物 健康純種遠(yuǎn)交雌性Wistar大鼠50只，8～10周齡，體質(zhì)量180～220g，采取隨機數(shù)字表分發(fā)，分為生理鹽水對照組(對照組，10只)、EAE模型組(模型組，20只)和丙酸睪酮干預(yù)組(雄激素干預(yù)組，20只)。成年豚鼠8只，雌雄不限，體質(zhì)量300～400g。所有動物均由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，置于恒溫恒濕的環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，每籠2～3只，自由攝食和飲水。

1．3 實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型制備參考文獻［5］方法，將豚鼠斷頭處死，剪開枕骨及椎管剝離脊髓，去掉馬尾與脊髓膜。稱重，加入等量的生理鹽水，用勻漿機(YQ-3，日本株式社會)制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的脊髓勻漿(GPSCH)。再與等量的CFA(每毫升含卡介苗5mg)混勻后制成油包水型乳劑，置于4℃冰箱備用。模型組與治療組(雄激素干預(yù)組)均在足底真皮下及頸部3點共注射0．5ml GPSCH+CFA。對照組，在足底真皮下及頸部3點共注射0．5ml NS+CFA。

1．4 試驗動物分組及處理 隨機將大鼠分為3組，分別為對照組10只，模型組20只，治療組20只。(1)對照組:生理鹽水加完全弗式佐劑作為免疫原誘導(dǎo)造模后，腹腔注射無菌生理鹽水。(2)模型組:EAE模型建立后，腹腔注射無菌生理鹽水。(3)干預(yù)組:EAE模型建立后，腹腔注射丙酸睪酮。以致敏當(dāng)日為第0天，對照組與模型組于致敏當(dāng)日腹腔注射無菌生理鹽水，按2ml/kg劑量給予。干預(yù)組于致敏當(dāng)日腹腔注射丙酸睪酮，按2ml/kg劑量給予。

1．5 臨床評分 EAE神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn):0分，未發(fā)病;1分，動物尾部無力;2分，動物尾部無力+前肢或后肢中等無力;3分，前肢或后肢嚴(yán)重?zé)o力，將鼠翻倒后不能復(fù)位;4分，肢體癱瘓，將鼠翻倒后不能復(fù)位;5分，瀕死狀態(tài)。其中1～5分為實驗成功模型。規(guī)定致敏當(dāng)日為第0天，并在每日早晚各兩次觀察動物行為學(xué)方面的變化，予以詳細(xì)記錄，同時每天測一次體重。于21d時全部處死。

1．6 免疫組化方法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP處死后的模型組與治療組評分在1分及以上已取血的大鼠，正常組在免疫以后21d統(tǒng)一處死，取大腦、腦干和脊髓放在濃度為10%的甲醛中固定，然后包埋，切片，常規(guī)HE染色，砂羅硌花青法髓鞘染色，以及免疫組化染色，采取SP法:大腦、腦干和脊髓的石蠟切片，10μm厚，脫蠟后，檸檬酸高壓抗原修復(fù)，在加入3%H2O2室溫處理，正常血清封閉后，一次滴加一抗(1∶200稀釋)，4℃過夜，生物素標(biāo)記二抗，室溫下孵育15min，辣根酶標(biāo)記的鏈卵白素室溫下孵育15min，DAB染色，顯微鏡下觀察，顯色2～10min，中性膠封片，各步前均用0．01mol/L PBS(pH 7．2～7．5)沖洗5min×3次。圖像處理:每個動物取3張切片，每個切片隨機取互不重疊的3個視野，采用德國LEICA公司生產(chǎn)的病理分析儀(型號:DMR+Q550)對圖像進行分析，計算大腦、腦干、脊髓各部位GFAP的陽性細(xì)胞個數(shù)(個/視野)。

2 結(jié)果

2．1 建模情況 模型組大鼠平均于免疫后13d開始發(fā)病，治療組平均于免疫后17d開始發(fā)病，發(fā)病表現(xiàn)為活動減少、進食少、精神不振、體重減輕，先出現(xiàn)尾肌力降低，尾巴拖地不能抬起，繼而后肢無力、癱瘓。如表1所示，治療組的發(fā)病率40%，模型組的發(fā)病率為60%。治療組的潛伏期(20．87±1．13d)，比模型組的潛伏期(18．11 ±1．34d)延長，二者比較差異有顯著性(P＜0．05)。治療組的臨床評分(1．56±0．99 分)比模型組的臨床評分(1．87 ±0．73分)低，但二者比較差異無顯著性(P＞0．05)。這些結(jié)果表明處理組的雄激素干預(yù)可以延遲發(fā)病，降低發(fā)病率，但對病情嚴(yán)重程度無明顯改善。

表1 3組大鼠的行為學(xué)觀察(±s)

表1 3組大鼠的行為學(xué)觀察(±s)

組別 動物數(shù) 發(fā)病數(shù)(%) 潛伏期(d)臨床評分(分)正常對照組模型組雄激素干預(yù)組10 20 20 0－0 12(60%)8(40%)18．11 ±1．34 20．87 ±1．13 1．87 ±0．73 1．56 ±0．99

2．2 病理學(xué)改變 HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠在發(fā)病后，大腦、腦干和脊髓內(nèi)可見有大量淋巴細(xì)胞浸潤，聚集在小血管周圍呈袖套樣改變;雄激素干預(yù)組)仍可見炎癥細(xì)胞浸潤，以及“袖套樣”改變，但明顯少于模型組。炎性細(xì)胞浸潤以腦干最明顯，其次為脊髓，大腦最少。HE染色發(fā)現(xiàn)，發(fā)病的大鼠腦和脊髓結(jié)構(gòu)疏松，呈彌漫性脫髓鞘改變。結(jié)果表明，干預(yù)組大鼠的病理改變與模型組相比較，有不同程度的減輕。而正常對照組未見異常改變。這些結(jié)果與上述行為學(xué)觀察相一致，表明成功建模，而且雄激素具有明顯干預(yù)作用。

2．3 星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化 GFAP染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠免疫組化染色后可見星形膠質(zhì)細(xì)胞的樹突呈向心排列，細(xì)胞數(shù)較少，胞體不明顯;模型組大鼠在發(fā)病后可見胞體明顯增大，突起增長和增粗，GFAP免疫反應(yīng)明顯增強;治療組大鼠與正常對照組所見基本相同，星形膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)、數(shù)量和結(jié)構(gòu)上未發(fā)生明顯變化。

正常對照組及干預(yù)組與模型組的GFAP陽性細(xì)胞個數(shù)在大腦(P＜0．05)、腦干(P＜0．01)、脊髓(P＜0．05)中存在明顯差異;而治療組與正常組的GFAP陽性細(xì)胞個數(shù)并無明顯差異(P＞0．05)。與正常組相比，模型組的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量呈明顯上升，而經(jīng)過雄激素作用的治療組，其星形膠質(zhì)細(xì)胞在數(shù)量上與正常組相比并無差異(P＞0．05)。這些結(jié)果表明雄激素對星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加及結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化都起到了抑制作用(見圖1)。

圖1 各組大鼠大腦、腦干、脊髓中GFAP陽性細(xì)胞個數(shù)的變化

3 討論

EAE是人脫髓鞘疾病MS經(jīng)典的動物模型。EAE是由嚙齒類或靈長類動物的髓鞘素抗原進行免疫接種而誘導(dǎo)產(chǎn)生的，目前國內(nèi)外學(xué)者廣泛采取此動物模型來研究多發(fā)性硬化，是國際上公認(rèn)的多發(fā)性硬化癥研究的標(biāo)準(zhǔn)動物模型。常用于建立EAE模型的動物有SJL/J小鼠、B10PL小鼠、Lewis大鼠、豚鼠等，且上述動物模型在EAE模型建立中存在雌雄個體差異［5～7］。本實驗采用我國常見的非敏感系鼠Wistar大鼠，注射以豚鼠全脊髓和完全弗式佐劑自制成的混合乳劑(抗原)來制作多發(fā)性硬化動物模型［5］，模型組發(fā)病率為60%，與先前報道的Wistar大鼠對 EAE 具有一定的抵抗性一致［5，7］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)被證實在中樞神經(jīng)系統(tǒng)起著神經(jīng)調(diào)節(jié)、保護、pH平衡、神經(jīng)發(fā)育過程中的軸突生長控制、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和血腦屏障維護等作用。近年來研究認(rèn)為，星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎性脫髓鞘疾病髓鞘損傷早期異?；钴S，髓鞘脫失后可激發(fā)明顯的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)［10，11］。星形膠質(zhì)細(xì)胞是具有大量放射狀突起的小圓錐細(xì)胞，直徑為9～10μm，核大，呈圓形或卵圓形，染色質(zhì)稀少，核仁不明顯;胞漿中除含有一般的細(xì)胞器外，尚含有許多由膠質(zhì)絲(glial filament)組成的圓纖維結(jié)構(gòu)，呈交錯排列，在突起中的走向與突起縱軸平行。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要成分，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［8，9］。星形膠質(zhì)細(xì)胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理性損害起應(yīng)答反應(yīng)，EAE模型中的GFAP反應(yīng)明顯增強，反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及功能狀態(tài)同時受到了影響。星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化還反映在其表達的生長因子、堿性成纖維細(xì)胞因子等因子水平的變化上［10，11］。

性激素是影響星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重要因素之一［3，4，12］。雄激素是一類含有 19 個碳原子的甾體激素，雄激素能促進和維持精子發(fā)生、促使雄性性征的出現(xiàn)并維持其正常狀態(tài)、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、促進代謝和生長發(fā)育等功能。雄激素對不同腦區(qū)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及生物學(xué)行為，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞表達GFAP mRNA的水平等都有明顯的調(diào)節(jié)作用［7，13～15］。本實驗研究鏡下可見模型組大鼠在發(fā)病急性期可見胞體明顯增大，突起增長和增粗，GFAP免疫反應(yīng)明顯增強，治療組大鼠與正常對照組所見基本相同。統(tǒng)計學(xué)也表明，模型組與治療組GFAP陽性細(xì)胞個數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，模型組與正常對照組GFAP陽性細(xì)胞個數(shù)差異也是有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，治療組與正常對照組GFAP陽性細(xì)胞個數(shù)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。說明在EAE的發(fā)病過程中中樞神經(jīng)GFAP表達明顯增加，在雄激素的干預(yù)下，治療組中GFAP表達減少，與正常對照組無顯著差異。睪丸酮可能通過直接作用于神經(jīng)元的雄激素與雌激素受體而間接實現(xiàn)其對星形細(xì)胞的影響。睪丸酮對星形細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能也存在著直接作用途徑。但Chowen等人［14］的研究也發(fā)現(xiàn)，性激素對正常大鼠星形細(xì)胞的數(shù)量沒有顯著影響，這種不一致的原因尚不清楚，是否與睪丸酮促細(xì)胞分裂、增殖作用存在組織差異性，有待進一步研究。

本實驗應(yīng)用雄激素干預(yù)EAE，可見雄激素治療組HE與髓鞘染色改變沒有模型組明顯;治療組的發(fā)病率低于模型組，潛伏期長于模型組(P＜0．05)，臨床評分雖然治療組(1．56±0．99)低于模型組(1．87±0．73)，但統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異性，雄激素在改善臨床癥狀的效果不是很明顯，可能與樣本例數(shù)偏少有關(guān)，存在一定的誤差有關(guān)。總之，實驗結(jié)果表明，雄激素對EAE在治療上有一定的效果，但關(guān)于EAE及MS存在性別上的差異和雄激素在其中的作用機制目前仍不清楚［16～18］，隨著進一步的研究，將會有更全面的認(rèn)識，從而發(fā)現(xiàn)更有效的治療方法。

［1］McFarland HF，Martin R．Multiple sclerosis:a complicated picture of autoimmunity［J］．Nat Immunol，2007，8(9):913 －919．

［2］Whitacre CC．Sex differences in autoimmune disease［J］．Nat Immunol，2001，2(9):777 － 780．

［3］Nicot A．Gender and sex hormones in multiple sclerosis pathology and therapy［J］．Front Biosci，2009，14:4477 －4515．

［4］Tomassini V，Pozzilli C．Sex hormones:a role in the control of multiple sclerosis［J］?Expert Opin Pharmacother，2006，7(7):857 － 868．

［5］Dong M，Liu R，Guo L，et al．Pathological findings in rats with experimental allergic encephalomyelitis［J］．APMIS，2008，116(11):972－984．

［6］Conejo NM，González-Pardo H，Cimadevilla JM，et al．Influence of gonadal steroids on the glial fibrillary acidic protein-immunoreactive astrocyte population in young rat hippocampus［J］．J Neurosci Res，2005，79(4):488 －494．

［7］Gold R，Hartung HP，Toyka KV．Animal models for autoimmune demyelinating disorders of the nervous system［J］．Mol Med Today，2000，6(2):88 －91．

［8］Bannerman P，Hahn A，Soulika A，et al．Astrogliosis in EAE spinal cord:derivation from radial glia，and relationships to oligodendroglia［J］．Glia，2007，55(1):57 －64．

［9］Dong M，Liu R，Guo L，et al．Pathological findings in rats with experimental allergic encephalomyelitis［J］．APMIS，2008，116(11):972－984．

［10］Stevens DB，Gold DP，Sercarz EE，et al．The Wistar Kyoto［RT1(l)］rat is resistant to myelin basic protein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis:comparison with the susceptible Lewis［RT1(l)］strain with regard to the MBP-directed CD4+T cell repertoire and its regulation［J］．J Neuroimmunol，2002，126(1－2):25－36．

［11］Sofroniew MV，Vinters HV．Astrocytes:biology and pathology［J］．Acta Neuropathol，2010，119:7 －35．

［12］Nair A，F(xiàn)rederick TJ，Miller SD．Astrocytes in multiple sclerosis:A product of their environment［J］．Cell Mol Life Sci，2008，65(17):2702－2720．

［13］Gold SM，Voskuhl RR．Estrogen and testosterone therapies in multiple sclerosis［J］．Prog Brain Res，2009，175:239 －251．

［14］Garcia-Segura LM，Torres-Aleman I，Naftolin F．Astrocytic shape and glial fibrillary acidic protein immunoreactivity are modified by estrsdiol in primary rat hypothalamic cultures［J］．Brain Res Dev，1989，47(2):298 －302．

［15］Chowen JA，Busiguina S，Garcia-Segura LM．Sexual dimorphism and six steroid modulation of glial fibrillary acidic protein messenger RNA and immunoreactivity levels in the rat hypothalamus［J］．Neuroscience，1995，69(2):519 －532．

［16］Meleaningi RC，Riva MA，F(xiàn)umagalli F，et al．Effect of progesterone，testosterone and their 5α-reduced metabolites on GFAP gene expression in type 1 astrocytes［J］．Brain Res，1996，711(1 － 2):10 －15．

［17］Palaszynski KM，Loo KK，Ashouri JF，et al．Androgens are protective in experimental autoimmune encephalomyelitis:implications for multiple sclerosis［J］．J Neuroimmunol，2004，146(1 －2):144 －152．

［18］Macció DR，F(xiàn)ozzatti L，Ditamo Y，et al．Nitric oxide mediates the suppressive effect of testosterone on cell proliferative response to myelin basic protein［J］．J Neuroimmunol，2008，199(1 － 2):63 －66．

［19］Yu HJ，F(xiàn)ei J，Chen XS，et al．Progesterone attenuates neurological behavioral deficits of experimental autoimmune encephalomyelitis through remyelination with nucleus-sublocalized Olig1 protein［J］．Neurosci Lett，2010，476(1):42 －45．