李思頡， 張顏波， 邵 國， 楊明峰， 牛敬忠， 呂國蔚， 吉訓(xùn)明

“低氧預(yù)適應(yīng)(hypoxic preconditioning，HP)”即預(yù)先短時間非致死性重復(fù)缺血/缺氧后，機體組織細胞獲得對隨后長時間致死性缺血/缺氧損傷的高度耐受性，廣泛存在于心、腦、腎、肝、腸等器官中。我們實驗室應(yīng)用行為學(xué)、生理學(xué)、形態(tài)學(xué)、神經(jīng)化學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，對低氧預(yù)適應(yīng)的效應(yīng)與機制進行了一系列系統(tǒng)的研究并已作出了基本的概括［1～10］。我們既往將低氧預(yù)適應(yīng)應(yīng)用到急性腦梗死致腦缺血性損傷的保護研究中，從腦梗死體積測定、神經(jīng)功能評定、細胞凋亡檢測3個方面證實了低氧預(yù)適應(yīng)對急性腦梗死致腦缺血性損傷具有保護作用［4］，但具體機制尚未明確。故實驗擬在已有基礎(chǔ)上，從血管新生的角度，通過低氧預(yù)適應(yīng)后腦內(nèi)缺血半暗帶區(qū)血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和血小板內(nèi)皮細胞黏附因子-1(Platelet endothelial cell adhension molecule-1，PECAM-1/CD31)的變化，探討低氧預(yù)適應(yīng)對急性腦梗死的保護機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 清潔級Balb/c近交系小鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22g，雌雄不拘，隨機排列表法分為正常對照組、低氧對照組、低氧預(yù)適應(yīng)組，每組12只，由首都醫(yī)科大學(xué)動物部提供。數(shù)字隨機表法分為4組:正常對照組(N)，無任何處理;假手術(shù)組(C)，僅行冷光源照射，不注射玫瑰紅;急性腦梗死組(CI)，光化學(xué)法誘導(dǎo)小鼠腦皮質(zhì)梗死模型;低氧預(yù)適應(yīng)+急性腦梗死組(HP+CI)，低氧預(yù)適應(yīng)后復(fù)制光化學(xué)法誘導(dǎo)小鼠腦皮質(zhì)梗死模型。

1．2 實驗用主要試劑與儀器 立體定位儀(51600型，美國Stoelting公司)、冰凍切片機(LEICA CM1900型，瑞士徠卡公司)、激光共聚焦顯微鏡(Radiance 2100型，美國Bio-Red公司)、恒溫培育箱(WGP-350，上海安亭科學(xué)儀器廠)、小鼠抗人VEGF抗原單克隆抗體IgG、小鼠抗小鼠CD31抗原單克隆抗體IgG、羊抗小鼠FITC標(biāo)記的二抗(SANTA CRUZ公司)、PBS(武漢博士德公司)、SABC-FITC免疫熒光檢測試劑盒(武漢博士德公司)、玫瑰紅(美國Sigma公司)、冷光源(LG-150型，徐州恒達光學(xué)電子儀器有限公司)。

1．3 低氧預(yù)適應(yīng)模型的復(fù)制［1～10］將低氧對照組、低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠放入一個125ml的廣口瓶內(nèi)，立即用橡皮塞封緊，以動物出現(xiàn)第1次喘呼吸為低氧耐受極限的標(biāo)志，完成低氧暴露1次(H1);隨即再將低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠移入新的廣口瓶內(nèi)、封閉，依此再重復(fù)操作3次(H4)，復(fù)制低氧預(yù)適應(yīng)模型。正常對照組小鼠不進行低氧暴露。

1．4 光化學(xué)誘導(dǎo)小鼠腦皮質(zhì)急性腦梗死模型的制作［4］根據(jù)我室既往的方法［4］，室溫25℃條件下，腹腔注射水合氯醛0．35g/kg麻醉，經(jīng)尾靜脈緩慢注入100mg/kg的5%玫瑰紅，立體定位儀固定小鼠頭部，沿頭正中切口分離、暴露左側(cè)顱骨。以矢狀縫左側(cè)2mm、冠狀縫后2mm為中心、直徑3mm為照射野，使冷光源(150W、24V金屬鹵化燈為發(fā)光光源，光導(dǎo)纖維傳送，濾去全部紫外線與紅外線，投射出單一綠色光束，波長為530nm)光導(dǎo)纖維探頭垂直貼近暴露的顱骨。注射玫瑰紅后5min時打開冷光源，光照強度2Lx，照射10min后結(jié)束縫合頭部皮膚，局部碘酒消毒。假手術(shù)組僅照射冷光源，未注射玫瑰紅。

1．5 VEGF、CD31 FITC 免疫熒光檢測 在腦梗死模型復(fù)制后24h、72h處死動物，取出腦梗死缺血半暗帶腦組織，液氮速凍，行冰凍切片，片厚度約10μm。切片制備后避光濕盒內(nèi)行VEGF、CD31免疫熒光檢測。切片用0．1mol/L PBS沖洗3次，每次5min;加1∶10稀釋后的封閉羊血清10min;封閉血清棄液不洗;滴加1∶50稀釋的一抗，4℃過夜;0．1mol/L PBS沖洗3次，每次5min;滴加碘化丙啶(50μg/ml)37℃孵育10～15min;0．1mol/L PBS沖洗2次，每次5min;滴加 FITC標(biāo)記的二抗;0．1mol/L PBS沖洗2次，每次5min;PBS甘油(pH 8．5 ～9．5)封片，蓋玻片周圍涂指甲油。應(yīng)用Bio-Red Radiance 2100型激光掃描共聚焦顯微鏡操作系統(tǒng)的GheNe激光系統(tǒng)，Ar離子激光系統(tǒng)，掃描FITC標(biāo)記的陽性反應(yīng)物。掃描選用的參數(shù)為:激發(fā)光波長為554nm，觀測光為575nm，物鏡為40倍，掃描方式為點掃描，Zoom 為(1．0)。經(jīng) Lasersharp 2000 軟件(4．5．3)攝像分析。

1．6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有熒光圖片經(jīng)Lasersharp 2000軟件(4．5．3)處理后，每組隨機選取30張行熒光強度測定，數(shù)據(jù)以±s表示，由第一作者采用SPSS 10．0軟件包中的單因素方差分析(ANOVA)和Pearson相關(guān)進行統(tǒng)計處理，P＜0．05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2．1 VEGF、CD31腦內(nèi)表達時間變化 N、C組VEGF、CD31腦內(nèi)皮質(zhì)極少量表達;CI和HP+CI組小鼠24h VEGF主要表達于腦內(nèi)缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元(見圖1);72h則主要在缺血半暗帶區(qū)血管內(nèi)皮細胞表達(見圖2);24h、72h CD31均在缺血半暗帶區(qū)血管內(nèi)皮細胞表達(見圖3、圖4)。

2．2 各組VEGF表達熒光強度比較 CI和HP+CI組缺血半暗帶區(qū)VEGF表達明顯高于N組、C組(P＜0．01);HP+CI組在 24h、72h時缺血半暗帶區(qū)VEGF表達顯著高于CI組(P＜0．01)(見表1和圖1、圖2)。

2．3 各組CD31表達熒光強度比較 CI和HP+CI組缺血半暗帶區(qū)CD31表達明顯高于N組、C組(P＜0．01);HP+CI組在 24h、72h時缺血半暗帶區(qū)CD31表達顯著高于CI組(P＜0．01)(見表2和圖3、圖4)。

2．4 VEGF與CD31相關(guān)性分析 將4組動物為樣本進行VEGF與CD31直線相關(guān)(Pearson相關(guān))分析:VEGF與CD31成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0．571，P＜0．01。

表1 各組VEGF表達熒光強度比較(熒光強度±s)

表1 各組VEGF表達熒光強度比較(熒光強度±s)

CI和HP+CI組分別與 N、C 組比較，*P ＜0．01;HP+CI組與CI組比較，#P ＜0．01

NCC I HP+CI 5．08 ±1．03 5．24 ±1．01 43．98 ±4．94*52．43 ±5．76*#5．17 ±0．99 5．32 ±1．08 29．66 ±4．71*38．21 ±4．98*#

表2 各組CD31表達熒光強度比較(熒光強度，±s)

表2 各組CD31表達熒光強度比較(熒光強度，±s)

CI和HP+CI組分別與N、C組比較*P＜0．01;HP+CI組與CI組比較#P ＜0．01

熒光強度值分組24h 72h NCC I HP+CI 7．73 ±1．06 8．11 ±1．23 20．12 ±4．34*28．54 ±5．94*#8．08 ±1．01 8．34 ±1．23 24．97 ±4．39*33．41 ±4．16*#

3 討論

低氧預(yù)適應(yīng)是一種機體內(nèi)源性保護機制，其通過一系列復(fù)雜環(huán)節(jié)調(diào)動機體潛能減輕缺氧損傷，對機體起保護作用。在心臟缺血再灌注損傷、腦缺血再灌注、離體神經(jīng)元及海馬腦片培養(yǎng)等模型研究發(fā)現(xiàn)，低氧預(yù)適應(yīng)對繼發(fā)損傷有保護作用。HP機制相當(dāng)復(fù)雜:既涉及低氧預(yù)適應(yīng)過程中動物行為與代謝、動物機能系統(tǒng)功能、神經(jīng)形態(tài)學(xué)、動物離體腦與脊髓機能活動，更涉及神經(jīng)化學(xué)成分、分子神經(jīng)生物學(xué)等諸方面的變化［1～10］。眾所周知，急性缺血性腦卒中是臨床常見的急重癥之一，死亡率高，致殘危險性大，搶救急性腦梗死致腦缺血性損傷是其治療的關(guān)鍵，積極尋找腦缺血性損傷保護方法或藥物是研究的熱點或難點問題［11，12］。我們既往研究發(fā)現(xiàn):低氧預(yù)適應(yīng)腦保護機制應(yīng)用到腦梗死臨床治療研究中，從腦梗死體積測定、神經(jīng)功能評定、細胞凋亡檢測3個方面研究發(fā)現(xiàn)，低氧預(yù)適應(yīng)能明顯減少腦梗死面積，神經(jīng)功能評分明顯增加，細胞凋亡數(shù)量顯著減少，所以低氧預(yù)適應(yīng)能減少小鼠急性腦梗死體積、降低神經(jīng)功能評分和減少細胞凋亡，從而發(fā)揮腦梗死致缺血性損傷的保護作用［4］，但這種保護作用機制尚不明確。

血管新生進而血管生成治療是目前國內(nèi)外缺血性腦血管病研究的熱點，VEGF是一種多功能細胞因子，具有促進微動脈、小動脈血管通透性增加、血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及誘導(dǎo)血管生成等作用;缺血后腦組織VEGF及受體表達增加，尤其是缺血半暗帶的血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元表達明顯，并對缺血腦組織具有保護作用;CD31是血小板內(nèi)皮細胞黏附因子，可在血管內(nèi)皮中表達，故已成為臨床常用的反應(yīng)血管新生指標(biāo)［13～16］。故本實驗通過 VEGF和 PECAM-1/CD31的變化的視角，探討低氧預(yù)適應(yīng)對急性腦梗死保護作用的機制。

本研究實驗組CI和HP+CI組發(fā)現(xiàn)，VEGF在缺血早期(24h)主要在神經(jīng)元上表達，而在缺血后期(72h)則主要表達在內(nèi)皮細胞上，可能在缺血等應(yīng)激狀態(tài)下，機體首先保護生理功能重要且耐受性較差的組織細胞，而在后期則主要通過保護內(nèi)皮細胞和促進內(nèi)皮細胞增殖進而建立側(cè)枝循環(huán)，增加血液供應(yīng)，以便對缺血組織起到一個比較穩(wěn)定長久的保護性作用。此結(jié)果與國內(nèi)、外研究類似，Hayshi T等發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注模型大鼠VEGF僅見于神經(jīng)元表達［17］;劉亢丁等在局灶性腦缺血早期缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元呈也發(fā)現(xiàn)VEGF明顯表達，特別在海馬、皮質(zhì)對缺血敏感的神經(jīng)元［18］。N、C 組 VEGF、CD31極少量表達，說明正常情況下，無明顯血管新生情況;但在急性腦梗死后，CI組VEGF、CD31表達明顯增加，說明缺血后血管新生增加，促進缺血損傷恢復(fù);進一步發(fā)現(xiàn) HP+CI組與CI組比較，VEGF、CD31表達明顯增加，并且VEGF與CD31成正相關(guān)，說明低氧預(yù)適應(yīng)能增加急性腦梗死腦內(nèi)缺血半暗帶區(qū)血管新生，促進急性腦梗死功能恢復(fù)，從而說明低氧預(yù)適應(yīng)對急性腦梗死患者腦損傷具有一定保護作用，可認為是一種內(nèi)源性保護途徑。

總之，低氧預(yù)適應(yīng)通過增加急性腦梗死缺血半暗帶區(qū)VEGF和CD31的表達，促進血管新生，起到對急性腦梗死缺血性損傷的保護作用。

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圖1 24h缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元VEGF FITC染色(×40)

圖2 72h缺血半暗帶區(qū)血管內(nèi)皮細胞VEGF FITC染色(×40)

圖3 24h缺血半暗帶區(qū)血管內(nèi)皮細胞CD31 FITC染色(×40)

圖4 72h缺血半暗帶區(qū)血管內(nèi)皮細胞CD31 FITC染色(×40)