王鵬龍 程亞濤 汪 林 徐士勛 王艷慧 李 強 雷海民

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系，北京100102)

本文以丙酮/K2CO3作為反應(yīng)體系，利用溴代川芎嗪分別與齊墩果酸和去氧膽酸發(fā)生親核取代反應(yīng)，得到齊墩果酸和去氧膽酸衍生物，即齊墩果酸28-COOH和去氧膽酸24-COOH與丙酮基拼接的產(chǎn)物。有文獻［1-3］顯示齊墩果酸和去氧膽酸具有一定的抗血管生成活性，本課題組應(yīng)用雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)模型初步評價了這2種化合物的在體血管生成活性。本研究是對中藥活性成分的二次開發(fā)，不僅有助于解釋中藥組方配伍的科學(xué)內(nèi)涵，也是對創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)的有益探索。

1 材料和方法

1.1 儀器

X-5顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司)，溫度未經(jīng)校正;1HNMR和13CNMR由AM-500核磁共振儀(瑞士Bruker公司)測定，CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo);IR譜采用 Nicolet iS10型紅外光譜儀(美國Thermo公司)測定，KBr壓片;微量振蕩器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，解剖顯微鏡(日本Olympus公司320040型)。

1.2 試劑

川芎嗪(ligustrazine，TMP)(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司);齊墩果酸(oleanolic acid，OA)、去氧膽酸(deoxycholic acid，DA)(上海晶純實業(yè)有限公司);NBS(日照力德士化工有限公司);吸附性明膠海綿(南京金陵制藥廠);0.9%氯化鈉注射液(北京雙鶴藥業(yè))。

1.3 CAM模型及評價方法

CAM形成于胚胎早期，此時雞胚機體的免疫系統(tǒng)尚未完全建立，對各種異物幾乎不發(fā)生排斥反應(yīng)，將含藥載體置于其表面，可觀察藥物對血管生成的影響，該模型對抗血管生成藥物敏感，目前被采用于藥物篩選［4-5］。本文借助圖像處理軟件(Image Professional Plus 5.0)，以藥物干預(yù)后CAM新生血管(＜100 μm)數(shù)目為指標(biāo)，評價化合物對在體新生血管的生成活性。本實驗采用德國羅曼雞胚蛋，胚蛋由北京農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧養(yǎng)殖場提供，蛋質(zhì)量50～60 g。

1.4 齊墩果酸乙酰甲酯和和去氧膽酸乙酰甲酯的合成

1)溴代川芎嗪的制備：將30.000 g(157.89 mmol)川芎嗪(含3分子結(jié)晶水)溶于50 mL的苯溶液，加熱回流10 h，共沸脫水，得到無水川芎嗪。將10.000 g(73.53 mmol)無水川芎嗪溶于60 mL CCl4中，加入 N-溴代丁二酰亞胺9.170 g(NBS，51.52 mmol)，2者均勻攪拌于白熾燈照射下回流12 h，冷卻，減壓濃縮，殘余物至冰箱中靜置，得到溴代川芎嗪，為淡紅色半油狀物(圖1)。

圖1 溴代川芎嗪合成路線Fig.1 Synthesis of TMP-BrA：benzene，reflux，10 h，100%;B：CCl4，NBS，hv，reflux，10～12 h，70%;1：ligustrazine·3H2O;2：ligustrazine;3：bromo TMP.

2)齊墩果酸乙酰甲酯的合成：往0.464 g(2.16 mmol)溴代川芎嗪、0.985 g(2.16 mmol)齊墩果酸和25 mL無水丙酮的溶液中加入0.690 g(5 mmol)碳酸鉀。反應(yīng)化合物回流攪拌12 h，采用硅膠薄層監(jiān)測反應(yīng)，至原料基本消失后，停止反應(yīng)，過濾，減壓濃縮，加入3.3 g硅膠減壓蒸干拌樣，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯=5∶1洗脫，丙酮重結(jié)晶，得到無色晶體6(圖2)。

圖2 化合物齊墩果酸乙酰甲酯的合成Fig.2 The synthesis of compound OA-acetonyl derivativeC：acetone，K2CO3，reflux，12 h，31%;4：bromo ligustrazine;5：OA;6：OA-acetonyl derivative;7：3β-Hydroxyolea-12-en-28-oic acid-3，5，6-trimethylpyrazin-2-methyl ester;OA：oleanolic acid.

3)去氧膽酸乙酰甲酯的合成：往0.464 g(2.16 mmol)溴代川芎嗪、0.847g(2.16mmol)去氧膽酸和25 mL無水丙酮的溶液中，加入0.690 g(5 mmol)碳酸鉀。反應(yīng)化合物回流攪拌12 h，采用硅膠薄層監(jiān)測反應(yīng)，至原料基本消失后，停止反應(yīng)，過濾，減壓濃縮，加入3.3 g硅膠減壓蒸干拌樣，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯=5∶1洗脫，得到白色粉末9(圖3)。

圖3 化合物去氧膽酸乙酰甲酯的合成Fig.3 The synthesis of compound DA-acetonyl derivativeD：acetone，K2CO3，reflux，12 h，27%;4：bromo ligustrazine;8：DA;9：DA-acetonyl derivative;10：3α，12α-Dihydroxy-5β-dholanic acid-3，5，6-trimethylpyrazin-2-methyl ester;DA：deoxycholic acid.

1.5 齊墩果酸乙酰甲酯和去氧膽酸乙酰甲酯對新生血管生成的抑制活性

根據(jù)本課題組前期工作基礎(chǔ)，將德國羅曼雞胚蛋置于恒溫37℃、恒濕(65%)孵化箱中培養(yǎng)［6-7］。培養(yǎng)到第7天，在無菌的環(huán)境下于氣室端開啟1 cm2小孔，剝離上層氣室膜，迅速在CAM上分別植入載藥明膠海綿，包括齊墩果酸乙酰甲酯(10 μg/egg、40 μg/egg)、去氧膽酸乙酰甲酯(10 μg/egg、40 μg/egg)和空白組(0.9%氯化鈉注射液);之后，用醫(yī)用膠帶封口并繼續(xù)培養(yǎng)3 d。

實驗第11天，揭開封口膠帶，以甲醇-丙酮(1∶1)液固定10 min，剝離CAM膜置于載玻片上，解剖顯微鏡下拍照，通過圖像處理軟件(Image Professional Plus 5.0)對雞胚照片進行數(shù)據(jù)采集，采集直徑＜100 μm的新生血管個數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸乙酰甲酯和去氧膽酸乙酰甲酯結(jié)構(gòu)分析

1)齊墩果酸乙酰甲酯：TMP和NBS通過自由基反應(yīng)，制備中間體TMP-Br 7.75 g液體(圖1)。通過TMPBr與齊墩果酸在堿性條件下發(fā)生親核取代反應(yīng)，得到化合物6，無色晶體0.28 g(圖2)，產(chǎn)率31.0%，熔點219.7℃～220.6℃。

1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.75，0.79，0.92，0.93，0.96，1.01，1.17(s，3H，each，7 ×CH3)，3.234(m，1H，3，β-CH)，5.311(brs，1H，H-12)，4.62，4.56(ea，d，J=16.5 Hz，1H，H-1＇)，2.18(s，3H，H-3＇)，1.00～2.50(24H，三萜母核結(jié)構(gòu)中的亞甲基和次甲基氫信號)。

13C-NMR(125 MHz，CDCl3)：38.5(C-1)，27.2(C-2)，79.0(C-3)，38.8(C-4)，55.2(C-5)，18.4(C-6)，33.1(C-7)，39.3(C-8)，47.6(C-9)，37.1(C-10)，23.6(C-11)，122.6(C-12)，143.6(C-13)，41.8(C-14)，27.7(C-15)，23.2(C-16)，46.8(C-17)，41.3(C-18)，46(C-19)，30.7(C-20)，33.9(C-21)，32.7(C-22)，28.1(C-23)，15.6(C-24)，15.4(C-25)，17.0 (C-26)，25.9(C-27)，177.0(C-28)，32.4(C-29)，23.4(C-30)，68.1(C-1＇)，202.4(C-2＇)，26.4(C-3＇)。IR，cm－1：3559，2940，2863和1724。

2)去氧膽酸乙酰甲酯

通過TMP-Br與去氧膽酸在堿性條件下發(fā)生親核取代反應(yīng)，得到化合物9白色粉末0.19 g(圖3)，產(chǎn)率27.0%，熔點157.8℃～158.8℃。

1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.68(s，3H，18-CH3)，0.90(s，3H，19-CH3)，0.98(d，3H，21-CH3)，3.61(m，1H，3β-CH)，3.98(m，1H，12β-CH)，4.64(brs，2H，H-1＇)，2.15(s，3H，H-3＇)，1.00～2.50(28H，甾體母核結(jié)構(gòu)中的亞甲基和次甲基氫信號)。

13C-NMR(125 MHz，CDCl3)：35.0(C-1)，30.5(C-2)，71.8(C-3)，36.5(C-4)，42.1(C-5)，27.2(C-6)，26.1(C-7)，36.1(C-8)，33.7(C-9)，34.1(C-10)，28.7 (C-11)，73.1(C-12)，46.5(C-13)，48.3(C-14)，23.7 (C-15)，27.4(C-16)，47.3(C-17)，12.7(C-18)，23.2 (C-19)，35.2(C-20)，17.3(C-21)，31.6(C-22)，30.9 (C-23)，173.4(C-24)，68.2(C-1＇)，201.7(C-2＇)，26.1 (C-3＇)。IR，cm－1：3531，3492，2934，2862和1734。

圖4 CAM模型上化合物齊墩果酸乙酰甲酯和去氧膽酸乙酰甲酯對新生血管作用Fig.4 Microvascular proliferation of oleanolic acid-acetonyl derivative and deoxycholic acid-acetonyl derivative on CAM(50×)A：control for compound oleanolic acid-acetonyl derivative group;B：10 μg/egg for compound oleanolic-acid acetonyl derivative group;C：40 μg/egg for compound oleanolic acid-acetonyl derivative group;D：control for compound deoxycholic acid-acetonyl derivative group;E：10 μg/egg for compound deoxycholic acid-acetonyl derivative group;F：40 μg/egg for compound deoxycholic acid-acetonyl derivative group;OA：oleanolic acid;DA：deoxycholic acid;CAM：chorioallantoic membrane.

2.2 CAM新生血管抑制活性

1)形態(tài)學(xué)觀察：胚蛋經(jīng)過7 d的孵化，加藥3 d之后，在解剖顯微鏡下觀察給藥組與空白組的CAM新生血管生長情況，發(fā)現(xiàn)空白組新生毛細血管從載體邊緣輻射狀發(fā)出，其數(shù)目與給藥組相比明顯增多，詳見圖4。

2)抑制新生血管生成活性：去氧膽酸乙酰甲酯對CAM新生血管生成有明顯抑制作用，結(jié)果詳見表1。

表1 化合物齊墩果酸乙酰甲酯和去氧膽酸乙酰甲酯對CAM新生血管生成活性Tab.1 Microvascular proliferation of OA-acetonyl derivative and DA-acetonyl derivative on CAM

3 討論

Folkman J等［8］早在1971年就提出抑制新生血管生成可以有效的抑制腫瘤的生長和擴散，臨床實踐證明抗血管生成藥與化療藥合用可以大大提高對癌癥的治療效果［9］。CAM模型作為藥物體外抗血管生成活性評價的經(jīng)典模型已被廣泛采用［4-5］。本研究應(yīng)用CAM模型評價，發(fā)現(xiàn)化合物去氧膽酸乙酰甲酯對新生血管顯示了較強的抑制作用。

［1］ Lee D Y，Kim S K，Kim Y S，et al.Suppression of angiogenesis and tumor growth by orally active deoxycholic acidheparin conjugate［J］.J Control Release，2007，118(3)：310-317.

［2］ Sohn K H，Lee H Y，Chung H Y，et al.Anti-angiogenic activity of triterpene acids［J］.Cancer Lett，1995，94(2)：213-218.

［3］ 湯華成，趙蕾，張鵬霞，等.齊墩果酸對 K562細胞系VEGF表達影響的實驗研究［J］.中國老年學(xué)雜志，2007，27(24)：2371-2373.

［4］ Ribatti D.The chick embryo chorioallantoic membrane in the study of tumor angiogenesis［J］.Rom J Morphol Embryol，2008，49(2)：131-135.

［5］ Ribatti D.The chick embryo chorioallantoic membrane as an in vivo assay to study antiangiogenesis［J］.Pharmaceuticals，2010，3(3)：482-513.

［6］ Wang P L，She G，Yang Y，et al.Synthesis and Biological Evaluation of New Ligustrazine Derivatives as Anti-tumor A-gents［J］.Molecules，2012，17(5)：4972-4985.

［7］ 李漢青，伍賢志，柏冬，等.復(fù)方三黃膠囊抑制腫瘤血管生成的活性部位篩選［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(4)：172-175.

［8］ Folkman J.Tumor angiogenesis：Therapeutic implications［J］.N Engl J Med，1971，285(21)：1182-1186.

［9］ Shaked Y，Henke E，Roodhart J M，et al.Rapid chemotherapy－induced acute endothelial progenitor cell mobilization：implications for antiangiogenic drugs as chemosensitizing agents［J］.Cancer Cell，2008，14(3)：263-273.