張 敏 郭彩霞* 曾翔俊 王紅霞 張立克 杜鳳和

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心內(nèi)科，北京100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，北京100069)

研究［1］發(fā)現(xiàn)心肌缺血/再灌注損傷可以調(diào)動心臟自身保護機制，內(nèi)源性保護物質(zhì)的釋放在心臟自身保護中的作用尤其被關(guān)注。晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是一種膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，和其配體在細(xì)胞表面結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，參與糖尿病及其慢性合并癥［2］、炎性反應(yīng)［3］、腎衰竭［4］、心力衰竭［5］、腫瘤生長［6］及神經(jīng)元分化等多種生理和病理過程。可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物(soluble form of receptor for advanced glycation end products，sRAGE)是RAGE的細(xì)胞外段部分，可特異結(jié)合AGEs，但由于不具有胞內(nèi)段部分，不能進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而中斷上述生物效應(yīng)對抗多種疾病和病理過程。有研究［7］顯示sRAGE可以減輕心臟缺血/再灌注損傷。本課題組前期大體實驗［8］也證實內(nèi)源性sRAGE減少和缺血/再灌注損傷有關(guān)，但作用機制尚未明了。其是否直接作用于心肌細(xì)胞?是否通過影響氧化應(yīng)激而發(fā)揮作用尚未見報道。

故本文采用缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)大鼠心肌細(xì)胞損傷模型，證實外源性sRAGE直接作用于心肌細(xì)胞，通過干擾氧化應(yīng)激，進而拮抗缺血/再灌注損傷而發(fā)揮心肌保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物與儀器、試劑

新生(48 h以內(nèi))SD大鼠-雌雄不分〔購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2006-0009〕;超凈工作臺(上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Recvo公司，美國);倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本);DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國);優(yōu)等胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);膠原酶I、膠原酶Ⅱ(Sigma公司，美國);胰蛋白酶(Hyclone公司，美國);絲裂霉素C(Roche公司，美國);酶標(biāo)儀(Biorad公司，美國);噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司，美國);Cytotoxicity Detection Kit (LDH)(Roche公司，美國);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光染料(Sigma公司，美國);流式細(xì)胞儀(Bechman Coulter公司，美國);sRAGE(北京愛迪博生物科技有限公司)。

1.2 心肌細(xì)胞H/R模型制備

采用大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)［9］：新生大鼠，消毒胸腹部，開胸，摘取2/3心臟，剪碎(1 mm3)，消化酶反復(fù)消化，收集上清液，離心(1 000 r/min，10 min)，細(xì)胞重懸，于5%CO2、37℃條件下差速貼壁30 min，收集細(xì)胞懸液加入絲裂霉素C(2g/mL)，根據(jù)實驗所需將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。24 h后第1次細(xì)胞換液，72 h后用于實驗。

復(fù)制心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型：將72 h細(xì)胞放入自制的缺氧罐內(nèi)，通入混合氣體(2%O2、5% CO2、93%N2)3 h后，將細(xì)胞取出，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

實驗分組：①常氧組(Con)：細(xì)胞正常培養(yǎng)5 h;②常氧+sRAGE組(Con-sRAGE)：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入sRAGE余處理同Control組;③ 缺氧/復(fù)氧組(H/ R);④ 缺氧/復(fù)氧+sRAGE(H/R-sRAGE)組(實驗組)：向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入sRAGE后處理同H/R組。實驗結(jié)束時分別留取心肌細(xì)胞培養(yǎng)液及心肌細(xì)胞。

1.3 觀察指標(biāo)及測定方法

1.3.1 MTT比色法測定心肌細(xì)胞活力

篩選 sRAGE干預(yù)適宜濃度：不同濃度梯度sRAGE干預(yù)H/R心肌細(xì)胞(H/R組、H/R+sRAGE 300 ng/mL組、H/R+sRAGE 600 ng/mL、H/R+ sRAGE 900 ng/mL、H/R+sRAGE 1 500 ng/mL、H/R +sRAGE 2 100 ng/mL)接種于96孔板中處理后，每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，搖床緩慢振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀選擇490 nm波長檢測各孔吸光度值。

1.3.2 細(xì)胞上清LDH漏出含量測定

篩選 sRAGE干預(yù)適宜濃度：不同濃度梯度sRAGE干預(yù)H/R心肌細(xì)胞(分組同MTT)接種于96孔板中處理后，取各組細(xì)胞上清液50 μL，按試劑盒操作方法測定LDH。

1.3.3 細(xì)胞上清SOD活力、MDA含量測定

各組心肌細(xì)胞分別處理后，取細(xì)胞上清，分別采用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法測定SOD、MDA，具體實驗步驟按試劑盒操作說明。

1.3.4 DCFH-DA探針借助流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平

各組對數(shù)生長期心肌細(xì)胞分別處理后，棄去培養(yǎng)基，25 mmol/L HEPES洗 2遍;加入 5 μmol/L的DCFH-DA熒光染料100 μL，37℃避光負(fù)載30 min; HEPES洗2遍;加入胰酶消化細(xì)胞，1 100 r/min、室溫、離心8 min;棄去培養(yǎng)基，HEPES洗2遍，離心;棄上清，加入400 μL HEPES，在流式細(xì)胞儀上(激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm)以FS和SS為參數(shù)，選取活細(xì)胞，將其限定在Gate內(nèi)，進行分析。得到熒光強度值(MIF)所測MIF值與ROS含量呈否比。

1.3.5 細(xì)胞上清NO含量測定

各組心肌細(xì)胞分別處理后，取細(xì)胞上清，采用硝酸還原酶法測定NO含量，具體實驗步驟按試劑盒操作說明。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE)表示，各組間計量資料的比較采用單因素方差(one way ANOVA)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，則采用最小顯著差(least significant difference，LSD)法進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給予sRAGE對心肌細(xì)胞活力及LDH的影響

與H/R組相比，給予不同濃度sRAGE可以改善心肌細(xì)胞活力，在900 ng/mL時趨勢最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)(P＜0.01)。與H/R組相比，予以外源性sRAGE 900 ng/mL時LDH的漏出量最少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)(P＜0.01)。

2.2 心肌細(xì)胞上清MDA含量、SOD活力

900 ng/mL sRAGE干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞的 SOD和MDA，與H/R組相比，實驗組MDA含量減少(P＜0.01)，SOD活力增強(P＜0.05)(圖3、4)。

2.3 心肌細(xì)胞內(nèi)ROS活性及培養(yǎng)基NO水平

給予900 ng/mL RAGE后。與H/R組相比，實驗組熒光強度降低，即ROS含量降低(P＜0.05)(圖5)。

與H/R組相比，H/R-sRAGE組NO含量降低(P＜0.01)(圖6)。

3 討論

隨著冠狀動脈溶栓、介入和搭橋等內(nèi)外科冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)治療手段的迅速開展，防治心肌缺血/再灌注損傷成為研究的重點［10］。心臟缺血/再灌注損傷機制復(fù)雜［11］，涉及自由基增多、鈣超載、中性粒細(xì)胞激活、心肌細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮功能障礙、能量代謝障礙等。目前普遍認(rèn)為活性氧大量產(chǎn)生引發(fā)的心肌氧化應(yīng)激在缺血/再灌損傷的病理過程中發(fā)揮重要作用［12］。心肌缺血/再灌注損傷過程中產(chǎn)生大量氧自由基，引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷膜系統(tǒng)，促使細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，膜通透性及流動性改變;使具有酶活性的蛋白質(zhì)活性喪失或減弱。而這些損傷可能影響到心肌組織的功能，如能量代謝、離子電流、心肌收縮等方面。

晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)屬于多配體受體，表達于心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，在成熟的動物及人體中呈低水平表達、當(dāng)細(xì)胞處于激活或應(yīng)激狀態(tài)，如糖尿病、炎性反應(yīng)，受損細(xì)胞中RAGE的表達急劇增高。RAGE與晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)結(jié)合，致多個信號傳導(dǎo)途徑的激活，介導(dǎo)生物效應(yīng)。sRAGE是RAGE的細(xì)胞外段部分，通過RAGE自分泌及基質(zhì)金屬蛋白酶解作用形成，存在于循環(huán)血液中，可與細(xì)胞膜上的RAGE競爭AGEs，干擾AGEs-RAGE相互作用，由于不具有胞內(nèi)段部分，不能進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，所以不介導(dǎo)生物效應(yīng)，從而拮抗糖尿病慢性合并癥、動脈粥樣硬化、高血壓、缺血再灌注損傷、全身炎性反應(yīng)綜合征、阿爾茨海默病、衰老、癌癥等疾病和病理過程的進展。

圖6 給予900 ng/mL sRAGE后細(xì)胞上清NO含量Fig.6 NO Content in medium*P＜0.01 vs control，#P＜0.01 vs H/R;sRAGE：soluble form of receptor for advanced glycation end products;NO：nitigen monoxide;H/R：hypoxia/reoxygenation.

Falcone C［13］等研究證實在校正了危險因素后，血清中sRAGE低水平與冠狀動脈疾病危險性升高相關(guān);本課題組前期的實驗結(jié)果［8］顯示，內(nèi)源性sRAGE在常氧組和缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞無差別，但sRAGE下降的根本機制尚不清楚，我們認(rèn)為其原因可能是內(nèi)源性sRAGE的生成是神經(jīng)、體液、心肌細(xì)胞共同調(diào)節(jié)的。本研究采用培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，缺氧3 h/復(fù)氧2 h造成心肌缺氧/復(fù)氧損傷，與H/R組相比，予以不同濃度sRAGE組，心肌細(xì)胞活性增加，LDH漏出量減少，LDH漏出量多少可反映細(xì)胞膜的損傷，其外漏的程度也可間接反映心肌再灌注受損程度，說明外源性sRAGE直接作用于心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護性作用，并在900 ng/mL時作用最明顯(P＜0.01)。

鑒于自由基增多是造成再灌注損傷的主要機制，我們觀察sRAGE是否通過影響氧自由基而發(fā)揮作用。MDA是脂質(zhì)過氧化的共同產(chǎn)物，細(xì)胞中MDA含量?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映心肌細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度和細(xì)胞損傷的程度; SOD能清除氧自由基，阻斷脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，SOD活力的高低可反映機體清除氧自由基的能力。MDA和SOD是評價心肌缺血損傷的公認(rèn)指標(biāo)。由于在復(fù)灌階段，缺血部位的心肌會受到生化物質(zhì)的突然改變及能量代謝變化的影響。這些變化包括大量ROS產(chǎn)生，線粒體功能異常，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載及其他調(diào)控機制的異常［14］。在缺血復(fù)灌階段，大量ROS的產(chǎn)生引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞死亡。本研究表明，與H/R組相比，H/R+sRAGE組可以顯著降低MDA含量，升高SOD活力，減少細(xì)胞內(nèi)ROS含量，說明sRAGE能抑制脂質(zhì)過氧化過程，增強清除氧自由基的能力，降低原代心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧所致的胞內(nèi)ROS升高，提示sRAGE可能通過降低氧化應(yīng)激來拮抗心肌H/R損傷。這與文獻［15］報道的結(jié)論一致。

心臟缺血/再灌注損傷誘發(fā)NO生成，受NOS調(diào)控，NO是一種新型氧自由基，過量的NO可通過產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，參與強毒性氧自由基的形成;抑制多種與細(xì)胞代謝有關(guān)的酶，直接損傷DNA，促進細(xì)胞凋亡等途徑造成或加重組織、細(xì)胞損傷。本實驗研究結(jié)果顯示，與H/R組相比，實驗組NO含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，提示sRAGE對H/R心肌細(xì)胞的保護作用與減少NO的生成有關(guān)，從而減少了NO的損傷作用。這與體外實驗結(jié)果：sRAGE可能通過干擾NOS途徑減輕對缺血/再灌注心肌造成損傷的結(jié)果相符。NO的生成受eNOS和iNOS共同調(diào)控，sRAGE對H/R心肌細(xì)胞NO生成的影響究竟是通過干擾何種NOS而產(chǎn)生的，尚不清楚，有待進一步研究。

綜上所述，外源性sRAGE可以直接作用于H/R心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護性作用，其機制可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān);但其是否還通過其他機制拮抗缺血/再灌注損傷而發(fā)揮心肌保護作用，值得進一步探討。

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