劉雪梅，李繼英，蘇霞

(廣西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西南寧530001)

沙姜是姜科植物山柰Kaempferia galanga L.的干燥根莖，溫中化濕，行氣止痛，主治胃寒疼痛、牙痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷，藥用價(jià)值較高［1］。沙姜也是一味常用的壯藥(壯藥名為Sagieng)，用于治療咳嗽和肺病、促進(jìn)傷口愈合，壯族人民早已使用它并積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)［2］。除藥用外，還大量用作副食和調(diào)味劑。

據(jù)報(bào)道，山柰揮發(fā)油抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)化療藥物有協(xié)同增效作用;而揮發(fā)油中的肉桂酸酯類化合物，尤其是主要成分-反式和順式的對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(MEC)有抗促癌活性［3-6］。由于植物藥遺傳毒性低，因此對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯有較強(qiáng)的抗腫瘤利用價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。但是對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯不溶于水，嚴(yán)重影響了它的生物利用度［7-8］。而β-環(huán)糊精不僅能提高藥物的溶解度，還能改善藥物的生物利用度和穩(wěn)定性。

國(guó)內(nèi)常用均勻設(shè)計(jì)或正交設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化和處方篩選，但這兩種方法精度不夠，預(yù)測(cè)性不佳，國(guó)外很少采用。星點(diǎn)設(shè)計(jì)和效應(yīng)面優(yōu)化法是國(guó)外藥學(xué)工作者常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法，優(yōu)選條件預(yù)測(cè)性好;近年來(lái)國(guó)內(nèi)時(shí)有該法用于藥學(xué)研究的報(bào)道［9-13］。本實(shí)驗(yàn)采用飽和水溶液法制備對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化其最佳的制備工藝，為方便對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究。

1 儀器和材料

85-2恒溫磁力攪拌器(武漢精華科研儀器公司);Nexus470傅立葉紅外拉曼光譜儀(美國(guó)Nicolet公司);AE100電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);GC—14A氣相色譜儀(日本島津公司);FW 24A型壓片機(jī)(天津光學(xué)儀器廠);Agilent 8453紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司);CAMAG REPROSTAR 3薄層色譜儀(瑞士卡瑪公司)。

對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(武漢合中化工有限公司，批號(hào):20070802，純度≥99.0%);對(duì)甲基肉桂酸乙酯(批號(hào):0835-9601，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所);β-CD(廣東省郁南順中食品貿(mào)易有限公司);其余試劑為分析純，色譜純。

2 方法和結(jié)果

2.1 對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的制備［14］

經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，采用飽和水溶液法制備。在一定溫度下，稱取一定量的β-CD溶于水中，加熱溶解，制成飽和溶液;同時(shí)稱取一定量的對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯溶于95%乙醇中。待β-CD飽和溶液稍冷后，用恒壓分液漏斗將對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯乙醇溶液緩慢滴入飽和溶液中，恒溫40℃攪拌。繼續(xù)攪拌一定時(shí)間后，停止加熱，繼續(xù)攪拌，降至室溫，靜置，冷藏24 h，得沉淀，抽濾，洗滌，45℃干燥，稱質(zhì)量，得白色粉末狀的對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯包合物。

2.2 包合率和包合物產(chǎn)率測(cè)定氣相色譜法測(cè)定包合物中對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯［15］。

2.2.1 色譜條件SE-30石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。柱溫200℃，進(jìn)樣口溫度與檢測(cè)器溫度為250℃，載氣為氮?dú)狻?/p>

2.2.2 定量測(cè)定

2.2.2.1 樣品溶液制備精密稱取對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯對(duì)照品適量，加入甲醇超聲30 min，完全溶解后加甲醇至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密稱取適量包合物置量瓶中，加適量甲醇超聲處理，溶解后加至刻度，搖勻制成供試液。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯對(duì)照品溶液分別配成質(zhì)量濃度為1.0、0.5、0.25、0.125、0.075 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液各4 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以各質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=6×106x－205 745，r=0.999 5，表明對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯在0.3～4 μg/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。對(duì)該方法進(jìn)行精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、24 h穩(wěn)定性測(cè)定、加樣回收試驗(yàn)，得到對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯的RSD分別為1.95%、1.36%、2.65%，回收率為101.65%。(n=5)

氣相色譜法測(cè)定供試液的對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯，每批3次，計(jì)算包合率和包合物產(chǎn)率。

包合率和包合產(chǎn)率的計(jì)算公式如下:

2.3 包合物的鑒定

2.3.1 紅外光譜法分別測(cè)定對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD物理混合物、對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物、對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯的溴化鉀壓片、β-CD的溴化鉀壓片在室溫下進(jìn)行紅外光譜，掃描范圍為500～4 000 cm－1。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，物理混合物的IR呈現(xiàn)出藥物和β-CD的疊加峰型特征。其—OH峰位(3 385.73 cm－1)與藥物的—OH峰位(3 387.48 cm－1)一致，C峰位(1 631.29 cm－1)和藥物的CO峰位(1 630.10 cm－1)一致，C—H峰位(2 924.92 cm－1)與β-CD的C—H峰位(2 925.86 cm－1)一致;而包合物的IR與物理混合物明顯不同，某些特征峰向高波數(shù)位移，強(qiáng)度大為減弱，如CO峰位升高(由1 630.10升至1 643.32 cm－1);某些特征峰向低波數(shù)位移，強(qiáng)度大為減弱，如—OH峰位降低(從3 387.48降至3 373.62 cm－1)，而包合物與β-CD的IR很相似，如C—H峰位(2 930.25 cm－1)與β-CD的C—H峰位(2 925.86 cm－1)相近，表明了藥物與β-CD產(chǎn)生了包合作用;但二者仍存在明顯差異。

2.3.2 薄層色譜法分別精密稱取適量對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯、對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物，用無(wú)水乙醇定容至2 mL;精密稱取包合物適量，加入石油醚，振蕩，洗滌，自然揮干醚液，用無(wú)水乙醇定容。各取10 μL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(10∶0.5∶1.5)為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出晾干，紫外儀366 nm下檢視;再以5%磷鉬酸溶液顯色，105℃烘干。結(jié)果顯示366 nm下可見(jiàn)對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯醇溶液、對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物醇液Rf值基本一致，而對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物醚洗溶液相應(yīng)位置無(wú)斑點(diǎn)，表明對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物已形成，見(jiàn)圖2。

2.3.3 紫外分光光度法精密稱取適量對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯原藥、β-CD、對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯+β-CD、對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物(含有對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯量相當(dāng)于原藥質(zhì)量)，5 mL無(wú)水乙醇溶解后加入蒸餾水定容至100 mL，以溶劑為空白溶液，于紫外分光光度計(jì)中在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯在210、225、309 nm處有最大吸收，β-CD和溶劑在λmax處無(wú)吸收干擾。包合物與原藥的吸收?qǐng)D譜基本相同，只是吸收強(qiáng)度稍減，表明包合物形成過(guò)程為一物理包合過(guò)程，未與β-CD發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，包合物基本形成。紫外吸收光譜見(jiàn)圖3。

圖1 β-環(huán)糊精(a)、對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(MEC)(b)、物理混合物(c)、包合物(d)的紅外圖譜Fig.1 IR spectra of β-CD(a)，MEC(b)，β-CD+MEC mixtures(c)and inclusion complexes(d)

圖2 對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯、對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of MEC and inclusion complex

2.4 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)考察，確定用藥比例(X1)、包合溫度(X2)和包合時(shí)間(X3)為星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察的影響因素，其水平范圍為:用藥比例為10%～20%，包合溫度為30～50℃，包合時(shí)間為30～150 min。以對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯的包合率和包合物產(chǎn)率為考察指標(biāo)。其中，包合率為工藝篩選的主要指標(biāo);在β-CD和對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯投料量一定的情況下，包合物產(chǎn)率為次要指標(biāo)。采用三因素五水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

圖3 對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(a)、β-CD(b)、物理混合物(c)、包合物(d)的此外吸收光譜Fig.3 UV absorption spectrum of MEC(a)，β-CD(b)，MEC+β-CD mixtures(c)and MEC-β-CD inclusion complexes(d)

2.5 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析將表2中對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯的包合率和包合物產(chǎn)率的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化為0～1間的歸一值，通過(guò)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換得到總評(píng)歸一值(總評(píng)OD值)。以用藥比例、包合溫度和包合時(shí)間為自變量，以各總評(píng)歸一值對(duì)自變量進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式擬合，以復(fù)相關(guān)系數(shù)(r)和P＜0.05為模型判定標(biāo)準(zhǔn)，Statistica 6.0軟件繪制效應(yīng)面確定對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的最佳工藝。結(jié)果如下:

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素和水平Tab.1 Factors and levels of central composite design

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和結(jié)果(n=3)Tab.2 Result of central composite design(n=3)

多元線性擬合方程:y(OD)=－0.799 1+0.004 2X1+0.026 8X2+0.001 9X3，r=0.644 4，F(xiàn)(3，11)=2.603 4，P=0.104 7＞0.05，表明線性擬合不佳，不宜用線性模型。

二項(xiàng)式擬合方程:y(OD)=－12.744 6+0.663 8X1+0.332 2X2+0.032 0X3－0.000 6X1X2+0.000 6×10－2X1X3－0.000 1X2X3－0.021 2X21+0.003 6X22－0.000 2X23，r=0.839 2，相對(duì)于線性擬合有大幅提高，但有多項(xiàng)系數(shù)值的P值＞0.05，應(yīng)對(duì)方程刪項(xiàng)簡(jiǎn)化，提高其可信度。本實(shí)驗(yàn)以該方程作為分析及模型的預(yù)測(cè)，故未將模型進(jìn)一步簡(jiǎn)化。

由于效應(yīng)面圖只能表達(dá)含2個(gè)自變量的函數(shù)，故本實(shí)驗(yàn)固定其中1個(gè)自變量為中值，另外2個(gè)影響因素為自變量，總評(píng)OD值為因變量，以擬合的二項(xiàng)式方程為數(shù)學(xué)模型，繪制效應(yīng)面圖，并從效應(yīng)面上選取最佳的實(shí)驗(yàn)條件。見(jiàn)圖4～6。

圖4 用藥比例和包合溫度及其相互作用對(duì)總評(píng)OD值的影響(包合時(shí)間90 min)Fig.4 Correlative effects of proportion of MEC and inclusion temperature(with time of 90min)

圖5 用藥比例和包合時(shí)間及其相互作用對(duì)總評(píng)OD值的影響(包合溫度40℃)Fig.5 Correlative effects of proportion of MEC and inclusion time(with temperature of 40℃)

圖6 包合溫度和包合時(shí)間及其相互作用對(duì)總評(píng)OD值的影響(用藥比例15%)Fig.6 Correlative effects of inclusion temperature and time(with 15%proportion of MEC)

由圖4～6可知，總評(píng)OD值隨著用藥比例、包合時(shí)間和包合溫度的增加，先增加后降低。結(jié)合包合物制備的實(shí)際情況，確定對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的較佳工藝為:用藥比例為15%，溫度為45℃，時(shí)間為90 min。經(jīng)過(guò)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得OD平均值為0.972 2，與模型方程理論預(yù)測(cè)值(0.994 8)的偏差為－2.26%，表明本工藝二項(xiàng)式擬合效果良好，可信度高。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，選用飽和水溶液法制備包合物，操作簡(jiǎn)便，適于工業(yè)化生產(chǎn);采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選包合物的制備工藝，預(yù)測(cè)性好，為下一步研制對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯包合物的新劑型奠定了基礎(chǔ)。

鑒于前期實(shí)驗(yàn)條件和時(shí)間的限制，本實(shí)驗(yàn)后期將進(jìn)行對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯-β-CD包合物的溶解性變化、體外釋放度和穩(wěn)定性試驗(yàn)，為優(yōu)化對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯包合物工藝設(shè)計(jì)提供定量的科學(xué)依據(jù)。

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