錢根林 樊彥紅 潘冬春

（1.吳江市畜牧獸醫(yī)站，吳江 215200；2.吳江市松陵動物防疫站，吳江 215200）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征又稱豬高致病性藍(lán)耳病，由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）感染所致。該病在中國的流行和分布十分廣泛，危害日趨嚴(yán)重，成為威脅豬場的以繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染性疾病，目前該病已存在于世界上所有養(yǎng)豬的國家及地區(qū)，且一般與圓環(huán)病毒等混合感染，已成為對養(yǎng)豬業(yè)具有重大危害的動物疫病，由于目前尚無有效藥物可對PRRS病豬進(jìn)行治療，在臨床上主要是依靠注射PRRSV的疫苗對易感動物進(jìn)行免疫，然后定期對抗體進(jìn)行監(jiān)測并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果制訂相應(yīng)的免疫措施的方法對本病進(jìn)行預(yù)防。本文簡要介紹了PPRS檢測方法的研究概況。

1 PRRSV病原的檢測

針對PRRSV的病原進(jìn)行的檢測，主要是靠分離PRRSV，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和病毒鑒定。目前報道的用于培養(yǎng)PRRSV的細(xì)胞有豬肺巨噬細(xì)胞（PAM）、MA104 細(xì)胞系的克隆株Marc-145 及HS2H 細(xì)胞、CL2421 細(xì)胞[1-2]。PAM對PRRSV有較高的敏感性，大多數(shù)毒株均適應(yīng)該細(xì)胞，特別是歐洲毒株，且產(chǎn)毒量高。但由于PAM存在豬肺原性病原體的污染，制備的技術(shù)難度大，難以獲得均質(zhì)的PAM等問題，應(yīng)用受到限制。Marc-145 細(xì)胞在接種后4～7 d出現(xiàn)細(xì)胞呈灶狀變圓，膨大之后皺縮脫落成灶狀空洞，病料以血清和肺組織樣本分離率為最高，血清樣本最為方便。用HS2H細(xì)胞作為PRRSV分離用細(xì)胞，具有較高的敏感性，細(xì)胞病變典型，并且由于它是傳代細(xì)胞系，制備簡單，容易獲得，適宜于一般實驗室培養(yǎng)、分離PRRSV。

2 PRRSV的血清學(xué)檢測

血清學(xué)檢測技術(shù)主要包括免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫膠體金技術(shù)、間接免疫熒光試驗（IFA）和血清中和試驗（SN）等。血清學(xué)檢測技術(shù)因操作簡便，且敏感性和特異性較高，已成為豬繁殖與呼吸障礙綜合征的主要檢測方法之一。

IPMA是PRRS抗體檢測的重要方法之一。此法敏感性和特異性都比較好?？捎糜赑RRSV的抗原檢測、病毒鑒定及血清抗體檢測。Wensvoor等建立的IPAM檢測PRRS抗體至今仍是歐洲常用的檢測手段[3]。IPMA具有特異性，敏感性結(jié)果與IFA相似。但此法在判定上有主觀性，且費時，檢測價格貴。血清中和試驗（SN）檢測PRRS 抗體特異性高，但因PRRS中和抗體出現(xiàn)晚而不適宜于早期診斷。Yoon等[4]人通過添加20%新鮮豬血清或豚鼠血清提高補體含量對SN 法進(jìn)行改良，能夠檢出感染后的9～11 d的抗體。PRRS中和抗體持續(xù)時間可長達(dá)6個月，此法可用于PRRS后期診斷和區(qū)分PRRSV毒株。

酶聯(lián)免疫吸附試驗因其條件要求低，操作簡單，穩(wěn)定性好，特異性敏感性高適用于基層獸醫(yī)工作，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于PRRSV抗體檢測。建立此項診斷技術(shù)的關(guān)鍵在于病毒的細(xì)胞培養(yǎng)和病毒作為ELISA 抗原的純化處理。Cho 等[5]應(yīng)用Triton- X100 制備獲得高純度的ELISA 抗原，輔以高效封閉試劑，使該法具有高特異性、高敏感性和快速經(jīng)濟(jì)的特點。此法優(yōu)于IMAP，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中PRRSV抗體的檢測。Seuberlich 等[6]報道了用競爭ELISA來檢測PRRSV，同時與間接免疫熒光試驗（IFA）和傳統(tǒng)ELISA技術(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示其敏感性和特異性都很高，可以作為日常的診斷和監(jiān)測方法。

免疫膠體金技術(shù)是近年來發(fā)展起來的快速診斷技術(shù)，目前已有商品化的膠體金試紙出售，該法操作簡單，診斷時間短，適合基層推廣使用，但是在基層使用中發(fā)現(xiàn)有假陽性和假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn)，因此需要在檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度方面進(jìn)行提高，滿足生產(chǎn)需要。

3 分子生物學(xué)診斷

PRRSV的分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括：反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（RTPCR），核酸探針技術(shù)和DNA微陣列技術(shù)。

RT-PCR 是檢測PRRS的主要手段。其原理是擴(kuò)增病毒特異而保守的基因片段，PRRSV 主要是擴(kuò)增ORF7。RT-PCR提供了一種良好的可替代細(xì)胞培養(yǎng)檢測PRRSV 的方法。

Christopher 等[7]首先建立了檢測豬精液中PRRSV的RT-PCR方法，該方法快速、敏感、可靠、實驗接毒92 d后，仍可從豬精液中檢測病毒RNA。在RT- PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的巢式PCR、定量Real-Time RT-PCR，巢式RT-PCR 均可用于PRRSV的檢測和定型，還提高了檢測的敏感性。

Sur 等[8]以PRRSV 的RNA為模板，通過RT-PCR 擴(kuò)增ORF7 中的433 bp 片段，應(yīng)用地高辛標(biāo)記方法制備PRRSV 特異性cDNA 探針，建立了檢測PRRSV原位雜交技術(shù)，該法可在肺、淋巴組織、肺泡巨噬細(xì)胞（尸體剖檢后灌洗獲得）、淋巴結(jié)、腎臟的感染細(xì)胞內(nèi)檢測到PRRSV 的RNA，較免疫組化具有更高的敏感性和特異性，特別適合感染后期的細(xì)胞內(nèi)PRRSV的RNA的檢測。該方法不僅能夠證明豬體內(nèi)確實存在有PRRSV，而且能夠?qū)RRSV 在體內(nèi)器官中的動態(tài)分布情況進(jìn)行追蹤檢測。

Lee 等[9]建立了基因芯片技術(shù)用于GP4 和GPS 對細(xì)胞基因表達(dá)影響的研究。以Hela 細(xì)胞系為PRRSV GP5 蛋白穩(wěn)定的表達(dá)載體，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、Western 雜交和免疫沉淀試驗均未觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；同時還檢驗了Marc-145 細(xì)胞與HeLa 共同培養(yǎng)時GP5表達(dá)對Marc-145 細(xì)胞的影響也未發(fā)現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的存在。使用細(xì)胞凋亡芯片檢測證實GP5 表達(dá)不能引起細(xì)胞凋亡，由于GP5 的表達(dá)與免疫反應(yīng)有關(guān)，因此其表達(dá)譜能用于PRRVS的診斷。

[1] Park JY，Kim HS，Seo SH. Characterization of interaction between porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine dendritic cells[J]. J Microbiol Biotechnol，2008，18（10）：1709-1716.

[2] Li G，Huang J，Jiang P，et al. Suppression of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication in MARC-145 cells by shRNA targeting ORF1 region[J]. Virus Gennes，2007，35（3）：673-679.

[3] Wensvoort G，de Kluyver EP，Luijtze EA，et al. Antigenic comparison of lelystad virus and swine infertility and respiratory syndrome（SIRS）virus[J]. J Vet Diagn Invest，1992，4（2）：134-138.

[4] Kim WI，Lee DS，Johnson W，et al. Effect of genotypic and biotypic differences among PPRS viruses on the serologic assessment of pigs for virus infection[J]. Vet Microbiol，2007，123（1-3）：1-7.

[5] Cho HJ，Deregt D，Joo HS. An ELISA for porcine reproductive and respiratory syndrome：production of antigen of high quality[J]. Can J Vet Res，1996，60（2）：89-93.

[6] Dea S，Wilson L，Therrien D，et al. Competitive ELISA for detection of antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus using recombinant E.coil-expressed nucleocapsid protein as antigen[J].J Virol methods，2000，87（1-2）：109-122.

[7] Christopher-Henningd J，Dammen M，Nelson E，et al. Comparison of RNA extraction methods for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus from boar semen[J]. J Virol Methods，2006，136（2）：248-53.

[8] Sur JH，Cooper VL，Galeota JA，et al. In vivo detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus RNA by in situ hybridization at different times postinfection[J]. J Clin Microbiol，1996，34（9）：2280-2289.

[9] Lee C，Rogan D，Erickson L，et al. Characterization of the porcine reproducctive and respiratory syndrome virus glycoprotein 5（GP5）in stably expressing cells[J]. Virus Res，2004，104（1）：33-38.