錢根林 樊彥紅 潘冬春
(1.吳江市畜牧獸醫(yī)站,吳江 215200;2.吳江市松陵動物防疫站,吳江 215200)
豬繁殖與呼吸障礙綜合征又稱豬高致病性藍(lán)耳病,由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)感染所致。該病在中國的流行和分布十分廣泛,危害日趨嚴(yán)重,成為威脅豬場的以繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染性疾病,目前該病已存在于世界上所有養(yǎng)豬的國家及地區(qū),且一般與圓環(huán)病毒等混合感染,已成為對養(yǎng)豬業(yè)具有重大危害的動物疫病,由于目前尚無有效藥物可對PRRS病豬進(jìn)行治療,在臨床上主要是依靠注射PRRSV的疫苗對易感動物進(jìn)行免疫,然后定期對抗體進(jìn)行監(jiān)測并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果制訂相應(yīng)的免疫措施的方法對本病進(jìn)行預(yù)防。本文簡要介紹了PPRS檢測方法的研究概況。
針對PRRSV的病原進(jìn)行的檢測,主要是靠分離PRRSV,然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和病毒鑒定。目前報道的用于培養(yǎng)PRRSV的細(xì)胞有豬肺巨噬細(xì)胞(PAM)、MA104 細(xì)胞系的克隆株Marc-145 及HS2H 細(xì)胞、CL2421 細(xì)胞[1-2]。PAM對PRRSV有較高的敏感性,大多數(shù)毒株均適應(yīng)該細(xì)胞,特別是歐洲毒株,且產(chǎn)毒量高。但由于PAM存在豬肺原性病原體的污染,制備的技術(shù)難度大,難以獲得均質(zhì)的PAM等問題,應(yīng)用受到限制。Marc-145 細(xì)胞在接種后4~7 d出現(xiàn)細(xì)胞呈灶狀變圓,膨大之后皺縮脫落成灶狀空洞,病料以血清和肺組織樣本分離率為最高,血清樣本最為方便。用HS2H細(xì)胞作為PRRSV分離用細(xì)胞,具有較高的敏感性,細(xì)胞病變典型,并且由于它是傳代細(xì)胞系,制備簡單,容易獲得,適宜于一般實驗室培養(yǎng)、分離PRRSV。
血清學(xué)檢測技術(shù)主要包括免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫膠體金技術(shù)、間接免疫熒光試驗(IFA)和血清中和試驗(SN)等。血清學(xué)檢測技術(shù)因操作簡便,且敏感性和特異性較高,已成為豬繁殖與呼吸障礙綜合征的主要檢測方法之一。
IPMA是PRRS抗體檢測的重要方法之一。此法敏感性和特異性都比較好??捎糜赑RRSV的抗原檢測、病毒鑒定及血清抗體檢測。Wensvoor等建立的IPAM檢測PRRS抗體至今仍是歐洲常用的檢測手段[3]。IPMA具有特異性,敏感性結(jié)果與IFA相似。但此法在判定上有主觀性,且費時,檢測價格貴。血清中和試驗(SN)檢測PRRS 抗體特異性高,但因PRRS中和抗體出現(xiàn)晚而不適宜于早期診斷。Yoon等[4]人通過添加20%新鮮豬血清或豚鼠血清提高補體含量對SN 法進(jìn)行改良,能夠檢出感染后的9~11 d的抗體。PRRS中和抗體持續(xù)時間可長達(dá)6個月,此法可用于PRRS后期診斷和區(qū)分PRRSV毒株。
酶聯(lián)免疫吸附試驗因其條件要求低,操作簡單,穩(wěn)定性好,特異性敏感性高適用于基層獸醫(yī)工作,現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于PRRSV抗體檢測。建立此項診斷技術(shù)的關(guān)鍵在于病毒的細(xì)胞培養(yǎng)和病毒作為ELISA 抗原的純化處理。Cho 等[5]應(yīng)用Triton- X100 制備獲得高純度的ELISA 抗原,輔以高效封閉試劑,使該法具有高特異性、高敏感性和快速經(jīng)濟(jì)的特點。此法優(yōu)于IMAP,被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中PRRSV抗體的檢測。Seuberlich 等[6]報道了用競爭ELISA來檢測PRRSV,同時與間接免疫熒光試驗(IFA)和傳統(tǒng)ELISA技術(shù)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示其敏感性和特異性都很高,可以作為日常的診斷和監(jiān)測方法。
免疫膠體金技術(shù)是近年來發(fā)展起來的快速診斷技術(shù),目前已有商品化的膠體金試紙出售,該法操作簡單,診斷時間短,適合基層推廣使用,但是在基層使用中發(fā)現(xiàn)有假陽性和假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn),因此需要在檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度方面進(jìn)行提高,滿足生產(chǎn)需要。
PRRSV的分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括:反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RTPCR),核酸探針技術(shù)和DNA微陣列技術(shù)。
RT-PCR 是檢測PRRS的主要手段。其原理是擴(kuò)增病毒特異而保守的基因片段,PRRSV 主要是擴(kuò)增ORF7。RT-PCR提供了一種良好的可替代細(xì)胞培養(yǎng)檢測PRRSV 的方法。
Christopher 等[7]首先建立了檢測豬精液中PRRSV的RT-PCR方法,該方法快速、敏感、可靠、實驗接毒92 d后,仍可從豬精液中檢測病毒RNA。在RT- PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的巢式PCR、定量Real-Time RT-PCR,巢式RT-PCR 均可用于PRRSV的檢測和定型,還提高了檢測的敏感性。
Sur 等[8]以PRRSV 的RNA為模板,通過RT-PCR 擴(kuò)增ORF7 中的433 bp 片段,應(yīng)用地高辛標(biāo)記方法制備PRRSV 特異性cDNA 探針,建立了檢測PRRSV原位雜交技術(shù),該法可在肺、淋巴組織、肺泡巨噬細(xì)胞(尸體剖檢后灌洗獲得)、淋巴結(jié)、腎臟的感染細(xì)胞內(nèi)檢測到PRRSV 的RNA,較免疫組化具有更高的敏感性和特異性,特別適合感染后期的細(xì)胞內(nèi)PRRSV的RNA的檢測。該方法不僅能夠證明豬體內(nèi)確實存在有PRRSV,而且能夠?qū)RRSV 在體內(nèi)器官中的動態(tài)分布情況進(jìn)行追蹤檢測。
Lee 等[9]建立了基因芯片技術(shù)用于GP4 和GPS 對細(xì)胞基因表達(dá)影響的研究。以Hela 細(xì)胞系為PRRSV GP5 蛋白穩(wěn)定的表達(dá)載體,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、Western 雜交和免疫沉淀試驗均未觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象;同時還檢驗了Marc-145 細(xì)胞與HeLa 共同培養(yǎng)時GP5表達(dá)對Marc-145 細(xì)胞的影響也未發(fā)現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的存在。使用細(xì)胞凋亡芯片檢測證實GP5 表達(dá)不能引起細(xì)胞凋亡,由于GP5 的表達(dá)與免疫反應(yīng)有關(guān),因此其表達(dá)譜能用于PRRVS的診斷。
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