孟繁凱 李再雨 徐 寧 楊福偉 李光民 羅毅男 葛鵬飛

(吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130021)

缺血后處理(ischemic postconditioning)是在腦缺血結(jié)束后再灌注開始時對再灌注進行一系列指定的有規(guī)則的機械性的終止，然后才給予腦組織充分的再灌注。最近研究表明缺血后處理也能對抗神經(jīng)組織的缺血再灌注損傷，減小大鼠腦梗死的體積〔1〕，改善兔脊髓缺血損傷后運動功能〔2〕。而且，缺血后處理能在缺血后實施，然而缺血后處理腦保護作用的機制尚不清楚。因此本文從腦缺血應激性后蛋白質(zhì)損傷的角度探討了缺血后處理腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 雄性Wistar大鼠，280～320 g，52只，由吉林大學實驗動物部提供。隨機分為假手術(shù)組，缺血組(阻斷大腦中動脈2 h，再恢復血流24 h)，后處理組(阻斷大腦中動脈2 h后，進行后處理，然后再恢復血流24 h)，每組14只。其中6只用于紅四氮唑(TTC)染色光鏡觀察，8只用于分析過氧化氫及蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物羰基化合物的含量。

1.1.2 實驗試劑與設備 試劑均購自Sigma公司。光學顯微鏡為日本產(chǎn)Olympus BX-51型。切片機為德國產(chǎn)Leica VT型，蛋白質(zhì)定量試劑盒購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用大腦中動脈閉塞法(MCAO)建立局灶腦缺血再灌注模型。大鼠禁食一夜，隨便飲水。苯巴比妥鈉腹腔麻醉(300 mg/kg)。采用頸部正中直線切口，長約3 cm，暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈。結(jié)扎頸外動脈近側(cè)端;用血管夾暫時夾閉頸總動脈，在夾閉遠端剪一口，向頸內(nèi)動脈插入制備好的魚線，插入大約19～22 mm，堵塞大腦中動脈及大腦前動脈的分叉部，缺血2 h。手術(shù)過程中大鼠體溫維持在(37±0.5)℃。對照組僅分離血管，不進行線栓。動物麻醉清醒后，按5分制評分標準進行評分。0分:無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:爬行時轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自行行走，意識喪失;1～3分的動物入選。

1.2.2 缺血后處理方法 缺血結(jié)束后，缺血組的線拴直接拔出;后處理組的線拴后撤5 mm，30 s后再插到大腦中動脈與大腦前動脈分叉處，堵塞30 s后再后撤5 mm。反復3個周期。

1.2.3 計算梗死腦體積 再灌注24 h后，每組至少有4只大鼠通過過量麻醉被處死。梗死腦組織體積的計算采用TTC染色法。正常組織染為紅色，梗死組織染為白色，再用10% 甲醛固定后照相。利用圖像分析儀測定每個腦片的梗死面積。以梗死腦組織體積占整個腦組織體積的百分比代表損傷程度。

1.2.4 勻漿及亞細胞結(jié)構(gòu)的分離 大鼠過量麻醉后，立即用100 ml冰磷酸鹽緩沖液(PBS)液(0.1 mol/L，pH7.4)經(jīng)心臟灌注腦組織，然后取腦組織，剝離背外側(cè)的新皮層腦組織，用Dounce勻漿器按照重量體積比1∶10加入勻漿緩沖液后抽壓20次進行勻漿。勻漿緩沖液(pH7.4)含有210 mmol/L甘露醇，20 nmol/L蔗糖，5 mmol/L Hepes，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。以1 000 r/min離心10 min去除細胞核及碎片，取上清以10 000 r/min離心10 min后將沉淀物用不含EDTA的勻漿緩沖液重懸。再次以1 000 r/min離心10 min，所得沉淀即含有線粒體。再將沉淀用不含EDTA的勻漿緩沖液重懸，用Bio-Rad蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.5 熒光測定法檢測線粒體內(nèi)過氧化氫的含量 參照文獻〔3〕，1 ml反應物包含 5 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，150μg線粒體蛋白，2 mmol/L p-羥基乙酸苯酯，16 U的辣根過氧化物酶，3 mmol/L氯化鎂和2 mmol/L疊氮華鈉。加入2 mmol/L的氰化鉀(溶于0.1 mol/L的碳酸鈉溶液)，37℃孵育30 min，采用熒光法檢測過氧化氫的釋放量(激發(fā)光波長為318 nm，吸收光波長為405 nm)。

1.2.6 分光光度計法檢測蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物羰基化合物含量參照文獻〔3〕，將10 mmol二硝基苯肼(溶于2.5 mol/L鹽酸溶液)加入勻漿緩沖液，室溫條件下避光孵育60 min。震蕩混勻后，加入20%的三氯乙酸，再用1∶1的乙醇醋酸混合物洗3遍。沉淀的蛋白質(zhì)重懸在pH6.5的20 mmol/L PBS(含6 mol/L鹽酸胍)。離心除去不溶物，檢測上清的光吸收值(370 nm)。采用湮滅系數(shù)22 000 M/cm計算蛋白糖基化產(chǎn)物含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用STATA7.0統(tǒng)計軟件，所有計量數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積的變化 采用梗死腦組織與整個腦組織的比值來代表腦組織的損傷情況。在缺血組，梗死腦組織的體積大約占整個腦組織體積的(37.91±2.16)%;缺血后處理使梗死腦組織的體積顯著下降，大約占整個腦組織的(21.38±1.65)%，組間比較差異顯著(P＜0.01)。

2.2 過氧化氫的變化 過氧化氫是氧化應激反應過程中形成的一個重要的氧自由基，因此檢測缺血后處理對腦組織中過氧化氫含量的影響。缺血組中過氧化氫的生成量是(1.24±0.22)mmol·mg－1蛋白·min－1;缺血再灌注處理后，下降為(0.84 ±0.17)mmol·mg－1蛋白·min－1(P ＜0.01)。假手術(shù)組過氧化氫含量為(0.45 ±0.08)mmol·mg－1蛋白·min－1。

2.3 蛋白質(zhì)羰基化產(chǎn)物的變化 假手術(shù)組中，羰基化合物的含量為(9.42±1.21)mmol/mg蛋白;缺血組中羰基化合物含量(15.61±1.92)mmol/mg，缺血后處理使其含量顯著下降到(11.71±1.37)mmol/mg蛋白(P＜0.01)。

3 討論

腦缺血再灌注后氧化應激反應被認為是導致腦損傷的一個主要因素〔4〕。已有研究表明，缺血再灌注過程中所產(chǎn)生的氧自由基可以導致神經(jīng)元內(nèi)的核酸、脂類等大分子的損傷，進而引發(fā)一系列的級聯(lián)反應，最后導致神經(jīng)元的凋亡〔5〕。雖然氧自由基對腦缺血再灌注后蛋白質(zhì)損傷尚未見報道，但以往研究表明氧化應激性蛋白質(zhì)損傷是導致細胞內(nèi)形成有細胞毒性的蛋白聚集物的重要原因〔6〕。在本文中，采用大鼠局灶性腦缺血模型證實在腦缺血再灌注過程24 h后損傷腦組織中的過氧化氫含量顯著增加，同時能夠反映蛋白質(zhì)氧化應激損傷的羰基化合物的含量在損傷腦組織中也顯著增加，這說明在腦缺血再灌注過程中存在氧化應激性蛋白質(zhì)損傷。

雖然以往對缺血后處理的腦保護作用機制進行較多的研究，發(fā)現(xiàn)缺血后處理能夠抑制凋亡作用〔7〕，阻斷導致神經(jīng)元凋亡的信號通路〔8〕，還能抑制氧化應激反應，減少氧化應激性脂質(zhì)損傷〔7〕。但是，缺血后處理對腦缺血再灌注后受損腦區(qū)內(nèi)蛋白質(zhì)的影響尚不清楚。在本文中，發(fā)現(xiàn)缺血后處理不僅能夠減少局灶性腦出血再灌注導致的腦組織損傷，使損傷腦組織體積由(37.91±2.16)%降低到(21.38±1.65)%，同時還減少了氧自由基之一過氧化氫的含量及氧化應激性蛋白質(zhì)損傷的產(chǎn)物羰基化合物的含量。因此，缺血后處理具有保護局灶腦缺血再灌注后腦組織損傷的作用，這種保護作用與氧化應激性蛋白質(zhì)損傷減少有密切關(guān)系。

氧化應激性蛋白質(zhì)損傷減少一方面與氧化應激反應降低有關(guān)，這在本文中已經(jīng)得到驗證;另一方面與損傷蛋白質(zhì)的降解有關(guān)系。目前研究認為，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物即帶有羰基的化合物需要經(jīng)過泛素蛋白質(zhì)途徑降解〔9〕。本研究沒有采用蛋白酶體特異性底物在體外檢測損傷腦區(qū)中蛋白酶體的活性變化，但是根據(jù)以往的研究結(jié)果推測在局灶腦缺血再灌注過程中蛋白酶體活性也會顯著下降。所以，蛋白酶體活性下降使得細胞內(nèi)因氧化應激反應受損的蛋白質(zhì)不能被降解，進而彼此粘連在一起形成具有細胞毒作用的蛋白聚集物，導致神經(jīng)元死亡。

本研究不僅進一步證實了缺血后處理具有顯著的腦保護作用，而且發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)損傷在缺血再灌注后神經(jīng)元損傷中具有重要的作用。還發(fā)現(xiàn)缺血后處理的腦保護作用與其能夠降低缺血再灌注后的氧化應激反應以及減少氧化應激性蛋白質(zhì)損傷有密切的關(guān)系，這為缺血后處理進一步應用到臨床實際工作中提供了理論支持。

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