孟繁凱 李再雨 徐 寧 楊福偉 李光民 羅毅男 葛鵬飛

(吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130021)

缺血后處理(ischemic postconditioning)是在腦缺血結(jié)束后再灌注開始時(shí)對(duì)再灌注進(jìn)行一系列指定的有規(guī)則的機(jī)械性的終止，然后才給予腦組織充分的再灌注。最近研究表明缺血后處理也能對(duì)抗神經(jīng)組織的缺血再灌注損傷，減小大鼠腦梗死的體積〔1〕，改善兔脊髓缺血損傷后運(yùn)動(dòng)功能〔2〕。而且，缺血后處理能在缺血后實(shí)施，然而缺血后處理腦保護(hù)作用的機(jī)制尚不清楚。因此本文從腦缺血應(yīng)激性后蛋白質(zhì)損傷的角度探討了缺血后處理腦保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性Wistar大鼠，280～320 g，52只，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血組(阻斷大腦中動(dòng)脈2 h，再恢復(fù)血流24 h)，后處理組(阻斷大腦中動(dòng)脈2 h后，進(jìn)行后處理，然后再恢復(fù)血流24 h)，每組14只。其中6只用于紅四氮唑(TTC)染色光鏡觀察，8只用于分析過氧化氫及蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物羰基化合物的含量。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備 試劑均購自Sigma公司。光學(xué)顯微鏡為日本產(chǎn)Olympus BX-51型。切片機(jī)為德國產(chǎn)Leica VT型，蛋白質(zhì)定量試劑盒購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用大腦中動(dòng)脈閉塞法(MCAO)建立局灶腦缺血再灌注模型。大鼠禁食一夜，隨便飲水。苯巴比妥鈉腹腔麻醉(300 mg/kg)。采用頸部正中直線切口，長約3 cm，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈近側(cè)端;用血管夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈，在夾閉遠(yuǎn)端剪一口，向頸內(nèi)動(dòng)脈插入制備好的魚線，插入大約19～22 mm，堵塞大腦中動(dòng)脈及大腦前動(dòng)脈的分叉部，缺血2 h。手術(shù)過程中大鼠體溫維持在(37±0.5)℃。對(duì)照組僅分離血管，不進(jìn)行線栓。動(dòng)物麻醉清醒后，按5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。0分:無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀;1分:不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分:爬行時(shí)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自行行走，意識(shí)喪失;1～3分的動(dòng)物入選。

1.2.2 缺血后處理方法 缺血結(jié)束后，缺血組的線拴直接拔出;后處理組的線拴后撤5 mm，30 s后再插到大腦中動(dòng)脈與大腦前動(dòng)脈分叉處，堵塞30 s后再后撤5 mm。反復(fù)3個(gè)周期。

1.2.3 計(jì)算梗死腦體積 再灌注24 h后，每組至少有4只大鼠通過過量麻醉被處死。梗死腦組織體積的計(jì)算采用TTC染色法。正常組織染為紅色，梗死組織染為白色，再用10% 甲醛固定后照相。利用圖像分析儀測定每個(gè)腦片的梗死面積。以梗死腦組織體積占整個(gè)腦組織體積的百分比代表損傷程度。

1.2.4 勻漿及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離 大鼠過量麻醉后，立即用100 ml冰磷酸鹽緩沖液(PBS)液(0.1 mol/L，pH7.4)經(jīng)心臟灌注腦組織，然后取腦組織，剝離背外側(cè)的新皮層腦組織，用Dounce勻漿器按照重量體積比1∶10加入勻漿緩沖液后抽壓20次進(jìn)行勻漿。勻漿緩沖液(pH7.4)含有210 mmol/L甘露醇，20 nmol/L蔗糖，5 mmol/L Hepes，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。以1 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞核及碎片，取上清以10 000 r/min離心10 min后將沉淀物用不含EDTA的勻漿緩沖液重懸。再次以1 000 r/min離心10 min，所得沉淀即含有線粒體。再將沉淀用不含EDTA的勻漿緩沖液重懸，用Bio-Rad蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.5 熒光測定法檢測線粒體內(nèi)過氧化氫的含量 參照文獻(xiàn)〔3〕，1 ml反應(yīng)物包含 5 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，150μg線粒體蛋白，2 mmol/L p-羥基乙酸苯酯，16 U的辣根過氧化物酶，3 mmol/L氯化鎂和2 mmol/L疊氮華鈉。加入2 mmol/L的氰化鉀(溶于0.1 mol/L的碳酸鈉溶液)，37℃孵育30 min，采用熒光法檢測過氧化氫的釋放量(激發(fā)光波長為318 nm，吸收光波長為405 nm)。

1.2.6 分光光度計(jì)法檢測蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物羰基化合物含量參照文獻(xiàn)〔3〕，將10 mmol二硝基苯肼(溶于2.5 mol/L鹽酸溶液)加入勻漿緩沖液，室溫條件下避光孵育60 min。震蕩混勻后，加入20%的三氯乙酸，再用1∶1的乙醇醋酸混合物洗3遍。沉淀的蛋白質(zhì)重懸在pH6.5的20 mmol/L PBS(含6 mol/L鹽酸胍)。離心除去不溶物，檢測上清的光吸收值(370 nm)。采用湮滅系數(shù)22 000 M/cm計(jì)算蛋白糖基化產(chǎn)物含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用STATA7.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積的變化 采用梗死腦組織與整個(gè)腦組織的比值來代表腦組織的損傷情況。在缺血組，梗死腦組織的體積大約占整個(gè)腦組織體積的(37.91±2.16)%;缺血后處理使梗死腦組織的體積顯著下降，大約占整個(gè)腦組織的(21.38±1.65)%，組間比較差異顯著(P＜0.01)。

2.2 過氧化氫的變化 過氧化氫是氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中形成的一個(gè)重要的氧自由基，因此檢測缺血后處理對(duì)腦組織中過氧化氫含量的影響。缺血組中過氧化氫的生成量是(1.24±0.22)mmol·mg－1蛋白·min－1;缺血再灌注處理后，下降為(0.84 ±0.17)mmol·mg－1蛋白·min－1(P ＜0.01)。假手術(shù)組過氧化氫含量為(0.45 ±0.08)mmol·mg－1蛋白·min－1。

2.3 蛋白質(zhì)羰基化產(chǎn)物的變化 假手術(shù)組中，羰基化合物的含量為(9.42±1.21)mmol/mg蛋白;缺血組中羰基化合物含量(15.61±1.92)mmol/mg，缺血后處理使其含量顯著下降到(11.71±1.37)mmol/mg蛋白(P＜0.01)。

3 討論

腦缺血再灌注后氧化應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是導(dǎo)致腦損傷的一個(gè)主要因素〔4〕。已有研究表明，缺血再灌注過程中所產(chǎn)生的氧自由基可以導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)的核酸、脂類等大分子的損傷，進(jìn)而引發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡〔5〕。雖然氧自由基對(duì)腦缺血再灌注后蛋白質(zhì)損傷尚未見報(bào)道，但以往研究表明氧化應(yīng)激性蛋白質(zhì)損傷是導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成有細(xì)胞毒性的蛋白聚集物的重要原因〔6〕。在本文中，采用大鼠局灶性腦缺血模型證實(shí)在腦缺血再灌注過程24 h后損傷腦組織中的過氧化氫含量顯著增加，同時(shí)能夠反映蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激損傷的羰基化合物的含量在損傷腦組織中也顯著增加，這說明在腦缺血再灌注過程中存在氧化應(yīng)激性蛋白質(zhì)損傷。

雖然以往對(duì)缺血后處理的腦保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行較多的研究，發(fā)現(xiàn)缺血后處理能夠抑制凋亡作用〔7〕，阻斷導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的信號(hào)通路〔8〕，還能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激性脂質(zhì)損傷〔7〕。但是，缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注后受損腦區(qū)內(nèi)蛋白質(zhì)的影響尚不清楚。在本文中，發(fā)現(xiàn)缺血后處理不僅能夠減少局灶性腦出血再灌注導(dǎo)致的腦組織損傷，使損傷腦組織體積由(37.91±2.16)%降低到(21.38±1.65)%，同時(shí)還減少了氧自由基之一過氧化氫的含量及氧化應(yīng)激性蛋白質(zhì)損傷的產(chǎn)物羰基化合物的含量。因此，缺血后處理具有保護(hù)局灶腦缺血再灌注后腦組織損傷的作用，這種保護(hù)作用與氧化應(yīng)激性蛋白質(zhì)損傷減少有密切關(guān)系。

氧化應(yīng)激性蛋白質(zhì)損傷減少一方面與氧化應(yīng)激反應(yīng)降低有關(guān)，這在本文中已經(jīng)得到驗(yàn)證;另一方面與損傷蛋白質(zhì)的降解有關(guān)系。目前研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物即帶有羰基的化合物需要經(jīng)過泛素蛋白質(zhì)途徑降解〔9〕。本研究沒有采用蛋白酶體特異性底物在體外檢測損傷腦區(qū)中蛋白酶體的活性變化，但是根據(jù)以往的研究結(jié)果推測在局灶腦缺血再灌注過程中蛋白酶體活性也會(huì)顯著下降。所以，蛋白酶體活性下降使得細(xì)胞內(nèi)因氧化應(yīng)激反應(yīng)受損的蛋白質(zhì)不能被降解，進(jìn)而彼此粘連在一起形成具有細(xì)胞毒作用的蛋白聚集物，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。

本研究不僅進(jìn)一步證實(shí)了缺血后處理具有顯著的腦保護(hù)作用，而且發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)損傷在缺血再灌注后神經(jīng)元損傷中具有重要的作用。還發(fā)現(xiàn)缺血后處理的腦保護(hù)作用與其能夠降低缺血再灌注后的氧化應(yīng)激反應(yīng)以及減少氧化應(yīng)激性蛋白質(zhì)損傷有密切的關(guān)系，這為缺血后處理進(jìn)一步應(yīng)用到臨床實(shí)際工作中提供了理論支持。

1 Xing B，Chen H，Zhang M，et al.Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat〔J〕.Stroke，2008;39(8):2362-9.

2 Jiang X，Ai C，Shi E，et al.Neuroprotection against spinal cord ischemiareperfusion injury induced by different ischemic postconditioning methods:roles of phosphatidylinositol 3-kinase-Akt and extracellular signalregulated kinase〔J〕.Anesthesiology，2009;111(6):1197-205.

3 Jolitha AB，Subramanyam MV，Asha-Devi S.Modification by vitamin E and exercise of oxidative stress in regions of aging rat brain:studies on superoxide dismutase isoenzymes and protein oxidation status〔J〕.Exp Gerontol，2006;41(8):753-63.

4 Chen SD，Yang DI，Lin TK，et al.Roles of oxidative stress，apoptosis，PGC-1α and mitochondrial biogenesis in cerebral ischemia〔J〕.Int JMol Sci，2011;12(10):7199-215.

5 Sugawara T，Chan PH.Reactive oxygen radicals and pathogenesis of neuronal death after cerebral ischemia〔J〕.Antioxid Redox Signal，2003;5(5):597-607.

6 Norris EH，Giasson BI.Role of oxidative damage in protein aggregation associated with Parkinson's disease and related disorders〔J〕.Antioxid Redox Signal，2005;7(5-6):672-84.

7 Yuan Y，Guo Q，Ye Z，et al.Ischemic postconditioning protects brain from ischemia/reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stressinduced apoptosis through PI3K-Akt pathway〔J〕.Brain Res，2011;1367:85-93.

8 Jung T，Grune T.The proteasome and its role in the degradation of oxidized proteins〔J〕.IUBMB Life，2008;60(11):743-52.

9 Ge P，Luo Y，Liu C，et al.Protein aggregation and proteasome dysfunction after brain ischemia〔J〕.Stroke，2007;38(12):3230-6.