龍 莉，張吉翔

(1南昌大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，2南昌大學醫(yī)學院，3江西省分子醫(yī)學重點實驗室，江西 南昌 330006)

葡萄球菌中毒性休克綜合癥(staphylococcal toxic shock syndrome，STSS)是一種潛在的致命疾病，以發(fā)燒、低血壓、剝脫性皮疹、腹瀉、嘔吐，最終導(dǎo)致休克和多臟器系統(tǒng)功能障礙等為特征。其女性發(fā)病率顯著高于男性，其中90%與月經(jīng)來潮有關(guān)，近年來檢測資料顯示，皮膚和外科感染引起的STSS有增多趨勢。

與STSS相關(guān)的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)中，大部分屬噬菌體Ⅰ群29型或52型。這些類型的SA能產(chǎn)生多種外毒素，其中包括中毒性休克綜合征毒素－1(toxic shock syndrome toxin－1，TSST－1)。它屬于一種超抗原(superantigen，SAg)，能超常激活T細胞，產(chǎn)生超生理量的細胞因子而發(fā)揮瀑布效應(yīng)，故在ng/L水平即可產(chǎn)生強大生物學效應(yīng)而發(fā)生嚴重的低血壓和休克。

1 葡萄球菌致病性島與中毒性休克

細菌的致病性是由其毒力因子決定的，而控制這些毒力因子(如菌毛、毒素、酶等)的基因可以是染色體上某些特殊的位點，也可以是由細菌內(nèi)的質(zhì)?；蚴删w所攜帶的遺傳成分，稱之為“致病性島”(pathogenicity island)。金黃色葡萄球菌超抗原是其引起中毒性休克的致病性島(Staphylococcus aureus pathogenicity islands，SaPIs)，它含有 14 ～27 kb 可移動遺傳因子家族，含有中毒性休克綜合征毒素基因(tst基因)，其臨界部分有17 bp同向重復(fù)序列，插入tyr B和trp位點，包含超抗原毒素基因、抗生素抗性基因及其它關(guān)于侵襲宿主的致病因素的基因[1－2]，在引起重大健康危害如中毒性休克綜合癥的細菌種群間傳播致病基因中起著決定性作用。SaPIs與其它移動遺傳因素相結(jié)合導(dǎo)致對多種抗生素有多重耐藥性的攻擊性菌株擴散和增殖的快速出現(xiàn)[3]，最顯著的是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)。因此，關(guān)于葡萄球菌致病性的傳播和定植的動員機制等元素的詳盡探索及說明至關(guān)重要。

葡萄球菌超抗原攜帶的SaPIs是不連續(xù)的，其編碼大約15000對堿基對，通常是堅定的整合在宿主基因中，其流動性和可伸展性是通過輔助噬菌體的誘導(dǎo)活化后，開始染色體整合基因的剪切及復(fù)制，然后SaPI的DNA被有效地殼體化，包裝在由噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白組成的具有小衣殼的噬菌體樣轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子中，導(dǎo)致頻率極高的內(nèi)部以及屬間轉(zhuǎn)移[4－5]。這個事件序列指的是SaPI剪切－復(fù)制－包裝循環(huán)周期(excision－replication－packaging，ERP)。由于其高頻率的轉(zhuǎn)移，SaPIs分布非常廣泛，在金黃色葡萄球菌菌株中含有2個或更多[6]。

2 Stl阻遏因子與葡萄球菌致病性島

SaPIs通常包括18～22個開放閱讀框架(open reading frames，ORFs)。把這些ORFs每一個都系統(tǒng)滅活，以明確它們的作用分型，發(fā)現(xiàn)2個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)噬菌體誘導(dǎo)SaPIs ERP周期的ORFs。這2個基因組是分開來轉(zhuǎn)錄的，并且構(gòu)成主要的SaPI基因組翻譯機構(gòu):其中一個就是SaPIbov1 ORF19，定向向右側(cè)方位，另一個是ORF20，定向向左側(cè)方位。這2個預(yù)測產(chǎn)物都包含1個典型的螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋基序轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，并因此被命名為Str(SaPI transcription rightward，SaPI右轉(zhuǎn)錄;ORF19)和 Stl(SaPI transcription leftward，SaPI左轉(zhuǎn)錄;ORF20)。然而研究發(fā)現(xiàn)，ORF19的框內(nèi)缺失并未影響噬菌體誘導(dǎo)SaPI的復(fù)制，而 Stl(ORF20)主要調(diào)節(jié) SaPIs ERP 周期[7]。

在輔助噬菌體裂解增長的情況下，致病性島內(nèi)維持在一個靜止原噬菌體樣的穩(wěn)定狀態(tài)，這是由一個類似于經(jīng)典前噬菌體抑制物的普遍性阻遏因子Stl控制，它連接在2個引進SaPI轉(zhuǎn)錄啟動因子之間的分叉部分，然后抑制大部分SaPI基因的表達[8]。突變SaPI的Stl被滅活，卻能在缺乏輔助噬菌體的情況下剪切和復(fù)制，表明輔助噬菌體的主要調(diào)控功能是緩解 Stl的抑制作用。SaPIbov1 ORF20和 SaPI1 ORF22::tetm在補體激活菌株中復(fù)制大大被抑制。有趣的是，雖然SaPIbov1 ORF20和SaPI1 ORF22的產(chǎn)物無相關(guān)序列，但是它們可能在某種程度上有交叉反應(yīng)[7]。由此可知，Stl編碼的主要阻遏物基因突變而失活后，SaPI的切除和復(fù)制可以在任何誘導(dǎo)噬菌體缺失的情況下發(fā)生，而誘導(dǎo)噬菌體的關(guān)鍵作用是減輕這種抑制作用，沒有誘導(dǎo)作用的噬菌體因為不能誘導(dǎo)去Stl阻遏作用而不能誘導(dǎo)致病性島基因的ERP周期。

現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，SaPI的脫阻遏由一個特定的、非必要的噬菌體蛋白質(zhì)結(jié)合到Stl，導(dǎo)致Stl－DNA復(fù)合物的破裂，這是SaPI活化的第一步，進而開始致病性島基因的ERP周期;并在不同情況下，SaPI結(jié)合不同的、非必需的噬菌體蛋白質(zhì)作為它的脫阻遏蛋白。因為它們有2個不同的、在遺傳上有各自鮮明特征的活性，所以被稱為“兼職”蛋白[8]。

目前研究比較明確的是2種輔助噬菌體80a(GenBank accession NC_009526)和w11(NC_004615)，以及3種不同的 SaPIs－SaPI1、SaPIbov1和SaPIbov2[2]。所有的 SaPIs都編碼 Stl同系物，但是這些蛋白十分保守，然而w11僅誘導(dǎo)SaPIbov1，80a誘導(dǎo)至少5種不同的有較多分叉的Stl蛋白的SaPIs(SaPI1、SaPI2、SaPIbov1、SaPIbov2、SaPIn17)。研究已證實輔助噬菌體和SaPI的特異性，因此推測噬菌體80a有多個SaPIs脫阻遏的基因。一個典型的SaPIs——SaPI1，有15.2 kb的基因組編碼21個ORFs，包含中毒性休克綜合征毒素基因、腸毒素K和Q基因[1]。在活化過程中，80a蛋白Sri(gp22)充當SaPI1阻遏因子Stl(SaPI1 gp22)的脫阻遏物的角色[8－9]。脫阻遏后就開始SaPI1剪切和復(fù)制，這個過程不需要80a基因產(chǎn)物[1]，然后是SaPI1 DNA的包裝，此過程需要SaPI1編碼的TerS蛋白質(zhì)[10]。

為了明白Stl的調(diào)控作用，研究者們使用質(zhì)粒pjp446、pjp447、pjp448 和 pjp449，分析 Stl、Str、xis 和rep在SaPIbov1或SaPIbov1d20存在時的表達。這些質(zhì)粒引入rn4220含有野生SaPIbov1(jp45)株或Stl突變株。Str、xis和 rep在野生SaPIbov1株中表達是被抑制的，但在Stl突變株中表達卻沒有被抑制。相反，通過 SaPIbov1 D20的突變，Stl表達可被抑制[7]?？梢?，Stl在SaPIbov1基因表達中有廣泛的抑制作用。如果抑制Stl阻遏作用，SaPIbov1和SaPI1能夠在沒有任何誘導(dǎo)噬菌體時自主復(fù)制。Stl是SaPI基因表達的主要阻遏物，也是一個自身感應(yīng)－自動誘導(dǎo)并有助于保持SaPI基因組處于關(guān)閉狀態(tài)。它預(yù)示SaPI誘導(dǎo)作用的初級目標是解除Stl的阻遏作用。

3 Stl與脫氧尿苷焦磷酸酶 (dUTP pyrophosphatase，dUTPase)及 dut基因

近來有學者提出與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的阻遏因子Stl結(jié)合編碼SaPI基因組區(qū)域內(nèi)特定啟動子這一過程由兼職蛋白質(zhì)相互作用調(diào)制。在這種相互作用中，φ11輔助噬菌體dUTPase蛋白與致病性島SaPIbov1的Stl阻遏因子結(jié)合，抑制SaPIbov1阻遏物作用[11－12]。

dUTPase活性和去抑制作用是dut基因產(chǎn)物的2個相互獨立功能。這一觀點的證據(jù)由80a的Dut的其中一個突變體提供，后者被選擇用于阻斷SaPI-bov1的干擾。該突變體也是D95E替代物，雖然它對于SaPI的去抑制是有缺陷的，但其可獲得dUTP酶活性。這證實了dUTP酶活性和去抑制作用是2個相互獨立的功能。因此，Dut代表了具有2種不同功能且在遺傳方面有獨立活性的一種真正“兼職”蛋白[8]。研究者預(yù)計Dut介導(dǎo)的去抑制涉及干擾Stl表達或Stl分裂，而不是功能的干擾，如Stl缺乏與噬菌體抑制物一致的共識裂解模式，SaPI誘導(dǎo)不涉及應(yīng)急反應(yīng)(SOS response)[5]。利用純化 His標記的蛋白和一個包括Stl－Str基因間區(qū)域的DNA探針，研究者發(fā)現(xiàn)SaPIbov1 Stl結(jié)合在這個位點上，但是w11 Dut卻沒有。這表明由于Stl的競爭，Dut不能作用于調(diào)節(jié)結(jié)合位點。因為這個片段包含Stl的啟動因子，所以Dut也不能抑制Stl的表達。Dut封閉Stl劑量依賴性介導(dǎo)凝膠移位，提示脫阻遏作用涉及到Dut與Stl的結(jié)合。噬菌體誘導(dǎo)SaPI脫阻遏作用的機制涉及具有脫阻遏物功能的蛋白質(zhì)與Stl結(jié)合而防止它與DNA結(jié)合。如果Dut使Stl與它的靶位點結(jié)合斷開，將誘導(dǎo)Stl抑制的SaPI基因轉(zhuǎn)錄。SaPI誘導(dǎo)的Dut激活轉(zhuǎn)錄通過專門破壞Stl－DNA復(fù)合物而發(fā)揮作用[8]。

4 結(jié)論與展望

引起中毒性休克的SaPIs受普遍性阻遏因子Stl的控制被動地存在于宿主染色體中;來自輔助噬菌體的“兼職蛋白”作用于致病性島脫Stl阻遏，可誘導(dǎo)致病性島活化。及時深入地研究Stl阻遏因子控制引起中毒性休克的SaPIs，將為研制更敏感的檢測手段、有效的減毒疫苗、基因工程疫苗和治療藥物開辟了新的途徑。但是仍有難題需解決，如是否Str的啟動子控制去Stl阻遏的、有活性的SaPI基因主要從右側(cè)轉(zhuǎn)錄?SaPI被誘導(dǎo)涉及的區(qū)域是哪部分?是否存在其它因子介導(dǎo)的干擾Stl阻遏作用?等等。

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