高金軍 聶文軍 張玲琴 趙朝美

（南京市浦口區(qū)獸醫(yī)站，南京 211800）

鴨疫里默氏桿菌?。≧A）是由鴨疫里默氏桿菌引起的一種接觸性、敗血性傳染病，又稱鴨傳染性漿膜炎、新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥、鴨疫巴氏桿菌病等。主要侵害雛鴨、雛鵝及雛火雞等多種禽類，多發(fā)于2～7周齡的雛鴨和雛鵝。10周齡時仍能呈現(xiàn)感染發(fā)病，種鴨及成年蛋雞不易感。潛伏期的長短與菌株的毒力、感染途徑以及應(yīng)激等因素有關(guān)，一般為1～3 d，有時長達1周左右。本病可經(jīng)呼吸道、消化道、刺破的足部皮膚的傷口、蚊子叮咬等多種途徑傳播{1}。具有較高傳染性，發(fā)病率在10%～60%之間，死亡率可達30%～90%以上[2]。病程可分為最急性、急性、亞急性和慢性。常見癥狀為精神沉郁、流眼淚和流鼻液、輕度咳嗽和打噴嚏、排綠色稀糞、共濟失調(diào)、頭頸震顫和昏迷。其特征性病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎。到目前為止，美國、英國、西班牙等均有此病報道。我國郭玉璞等于1982年在北京首次發(fā)現(xiàn)此病以來，在全國許多省區(qū)相繼有此病發(fā)生的報道。對浦口地區(qū)的可疑病例進行了分離與鑒定及藥敏試驗，以期為鴨疫里默氏桿菌病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

病料來源于南京浦口地區(qū)某鴨場?；鉴喤R床表現(xiàn)：嗜睡、縮頸、腿軟不愿走動或行動蹣跚，共濟失調(diào)，精神不振，食欲減少或不食，眼和鼻孔有漿液或黏液分泌物流出，排出黃色或黃綠色稀糞。部分病鴨臨死前出現(xiàn)痙攣、角弓反張等神經(jīng)癥狀。少數(shù)病例轉(zhuǎn)圈或倒退，共濟失調(diào)，病鴨逐漸消瘦、死亡。選擇具有典型纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎的病死鴨，無菌操作采集病死鴨的腦、心包液、脾及肝等組織器官。

1.1.2 培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂，均為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、鮮血瓊脂平板按常規(guī)方法制作。

1.1.3 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱，型號：DRP-9082，上海森信實驗儀器有限公司生產(chǎn)；

高壓滅菌鍋，型號：LDZX-30KBS，上海申安醫(yī)療儀器械廠生產(chǎn)；

架盤天平，型號：JPT-5，江蘇常熟衡器廠生產(chǎn)；

潔凈工作臺，型號：SW-CJ，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；

顯微鏡，型號：XSP-2C，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 生化反應(yīng)試管

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、硝酸鹽還原、硫化氫、甲基紅試驗、枸櫞酸鹽微量生化發(fā)酵試管，均為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 藥敏紙片

頭孢哌酮、頭孢唑啉、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿米卡星、紅霉素、氨芐西林、利復(fù)平、復(fù)方新諾明、磷霉素、新霉素、恩諾沙星、亞胺培南、強力霉素等15種藥物為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.6 實驗動物

實驗用雛鴨，購自非疫區(qū)養(yǎng)鴨戶的15日齡未免疫雛鴨，常規(guī)飼養(yǎng)觀察3 d，未發(fā)現(xiàn)任何異常后，供動物回歸試驗使用。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備：營養(yǎng)瓊脂37 g，蒸餾水1 L，加熱溶解后，121℃滅菌15 min；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基制備：麥康凱瓊脂55 g，蒸餾水1 L，加熱溶解后，121℃滅菌15 min；鮮血瓊脂培養(yǎng)基制備：將滅菌的普通瓊脂培養(yǎng)基加熱溶解，待冷卻至50℃左右，加入無菌的脫纖綿羊或家兔鮮血5%（既每項100 ml普通瓊脂加入鮮血5～6 ml）混合后，傾注于滅菌平皿（如果瓊脂溫度過高，鮮血加入后則成紫褐色，溫度過低，則鮮血加入瓊脂易凝不易混合。注意，混合時切勿產(chǎn)生氣泡）。待凝固后置37℃培養(yǎng)24 h，無菌檢驗合格方可應(yīng)用[3]。

1.2.2 細菌的分離與純化

無菌采取病死鴨的腦、心包液、脾及肝組織，接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、鮮血瓊脂平板上，置37℃燭缸中培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況，挑取可疑菌落進行涂片染色鏡檢，同時在普通瓊脂平板、麥康凱平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，置37℃溫箱中觀察是否生長，然后再挑取單個可疑菌落接種于鮮血瓊脂平板作進一步純化后保存鑒定[4]。

1.2.3 細菌的形態(tài)觀察

挑取平板上的單一疑似菌落，按常規(guī)方法進行革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.4 生化鑒定

從分離出的8株菌的純培養(yǎng)物中挑取單個典型菌落，分別做葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、硝酸鹽還原、硫化氫、甲基紅試驗、枸櫞酸鹽和靛基質(zhì)試驗，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗

對8株菌進行藥敏試驗，采用藥敏紙片法，按常規(guī)方法進行。將所分離出的8株菌分別各均勻劃線接種在血液瓊脂平板上，置37℃燭缸中培養(yǎng)24 h～48 h，觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑大于22 mm為高敏藥物，直徑18～22 mm者為中敏藥物，直徑18 mm以下者為低敏藥物，無抑菌圈的為不敏感藥物。

1.2.6 動物回歸試驗

隨機從8株細菌中選取5株細菌進行。首先將感染菌株菌株接種于血液瓊脂平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)48 h，刮取平板上所有菌落混于滅菌生理鹽水中制成細菌懸液，以平板培養(yǎng)活菌計數(shù)法確定活菌數(shù)量為3×108/ml～4×108/ml，每只18日齡健康肉鴨腿部皮下接種菌液0.5 ml，每株細菌感染4只18日齡健康雛鴨，同時設(shè)立滅菌生理鹽水注射對照組。接種后每日觀察記錄鴨的精神、食欲、飲水、糞便、運動及死亡情況，并對死亡鴨進行病理剖檢，并取死亡鴨的心血、肝組織按1.2.2方法進行細菌分離培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離

從臨床剖檢表現(xiàn)為典型纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎的病死鴨中，將腦、心包液、脾及肝等組織均接種于普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、鮮血瓊脂平板上，置37℃燭缸中培養(yǎng)24 h后，血液瓊脂平板上生長了圓形、光滑、濕潤、微隆起、半透明露珠狀，邊緣整齊，無色素的光滑型菌落，直徑約1～2 mm，無溶血現(xiàn)象。在普通瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上未見細菌生長。在不含CO2的普通恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上均不能生長[5]。將以典型病鴨分離到的8株細菌命名為RA1～RA8。

2.2 細菌的染色鏡檢

將RA1～RA8株細菌革蘭氏染色，均為陰性，油鏡下觀察為小桿菌，少數(shù)為橢圓型，無芽孢，多呈單個散在排列，偶見成雙或短鏈狀排列。美蘭染色可見菌體兩極濃染。

2.3 生化鑒定結(jié)果

RA1、RA2、RA3、RA4、RA5、RA6、RA7和RA8菌株均不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇等糖類，硝酸鹽還原、甲基紅試驗、枸櫞酸鹽試驗和靛基質(zhì)試驗均為陰性，不產(chǎn)生硫化氫[6]。這些生化特性與鴨疫里默氏桿菌相似。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

RA1、RA2、RA3、RA4、RA5、RA6、RA7和RA8對頭孢唑啉、頭孢哌酮、亞氨培南、新霉素均高度敏感，大部分菌株對氧氟沙星（RA3、RA5除外）、慶大霉素（RA6、RA7除外）、利福平（RA6除外）、磷霉素（RA2、RA4除外）、恩諾水利星（RA1、RA5除外）、強力霉素（RA2、RA3除外）中度敏感，大部分菌株對四環(huán)丙沙星、阿米卡星、紅霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明不敏感。

2.5 動物回歸試驗結(jié)果

實驗組小鴨在接種細菌后，24～120 h內(nèi)全部發(fā)病死亡，5株細菌引起發(fā)病和死亡情況基本相同。病死前癥狀為，精神沉郁、縮頸、不能站立、停止采食和飲水、眼鼻有分泌物、眼眶周圍濕潤、黃綠色水樣腹瀉。皮下注射部位發(fā)炎，有大量淡黃色較濃稠的滲出物，接種細菌3 d內(nèi)死亡鴨剖檢心包、肝臟、氣囊表面的纖維素性滲出不明顯，只見肝臟腫大淤血，接種細菌3 d后死亡病鴨剖檢心包、肝臟表面、氣囊有大量灰白色纖維素性滲出物，部分鴨心包膜與胸內(nèi)壁粘連，脾腫大。取病死鴨的腦，心血和肝組織涂片檢查，可見兩極濃染的小桿菌，單個或成對存在。心血和肝組織在血液瓊脂平板上劃線培養(yǎng)后分離到細菌，染色鏡檢，生化特性與接種菌一致。對照組未見任何臨床癥狀和病理變化，腦、心血及肝接種血液瓊脂平板培養(yǎng)后均無細菌生長。

3 分析與討論

（1）從臨床剖檢表現(xiàn)為典型纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎的病死鴨中，以無菌操作將腦、心包液、脾及肝組織劃線接種于普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、血液瓊脂平板，置于37℃燭缸中培養(yǎng)24 h，分離到8株細菌，采用了細菌培養(yǎng)特性、細菌形態(tài)、生化試驗等綜合方法進行，初步確定分離菌株為鴨疫里默氏桿菌，定為RA1～RA8菌株。從形態(tài)學(xué)來看，瑞氏染色鏡檢呈兩極濃染，這是多殺性巴氏桿菌和鴨疫里默氏桿菌的共同特征，可以和大腸桿菌相區(qū)別；從培養(yǎng)特性來看，鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌都能在血液瓊脂上生長，但鴨疫里默氏桿菌不能在麥康凱瓊脂上生長，而大腸桿菌能在麥康凱瓊脂上長出粉紅色菌落；通過生化試驗，可以和多殺性巴氏桿菌和大腸桿菌相區(qū)別，因為后兩者均能發(fā)酵糖，而鴨疫里默氏桿菌不能發(fā)酵糖[7]。

（2）因為RA血清型眾多，相互之間缺乏交叉免疫保護，鑒于鴨疫里默氏桿菌對許多抗生素敏感，長期以來，藥物防治一直是生產(chǎn)中控制該病的主要措施。但反復(fù)多次投藥既增大了養(yǎng)殖成本，且易出現(xiàn)耐藥菌株，給該病的防治帶來了極大的困難，本試驗選用了15種抗菌藥物對所分離的8株鴨疫里默氏桿菌進行了藥敏試驗，為該地區(qū)臨床用藥提供了一定的參考。藥敏試驗結(jié)果表明，該地區(qū)鴨疫里默氏桿菌耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，對大多數(shù)菌株敏感有效的藥物有頭孢類藥物頭孢哌酮、頭孢唑啉、亞胺培南、新霉素四種，氧氟沙星、慶大霉素、利福平、磷霉素、恩諾沙星、強力霉素對大多數(shù)菌株中度敏感或不敏感，而環(huán)丙沙星、阿米卡星、紅霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明對菌株不敏感。從經(jīng)濟上考慮，頭孢類藥物昂貴，使用后會增加養(yǎng)殖成本，該地區(qū)目前可選用慶大霉素、恩諾沙星、強力霉素等藥物進行防治。盡管如此，不同地區(qū)對不同抗菌藥的敏感性是不一樣的，這也提示臨床應(yīng)用抗菌藥防治該病時，必須結(jié)合藥敏試驗結(jié)果選擇高敏藥物或配合用藥才能起到預(yù)期的效果。不同抗菌藥的敏感差異性，可能與不同地區(qū)的血清型不同或不同地區(qū)用藥習(xí)慣不同產(chǎn)生抗藥性有關(guān)[8]。

（3）本病的診斷必須注意和大腸桿菌相區(qū)別，兩者在臨床癥狀和剖檢病變上雖然難以區(qū)別，但在細菌的培養(yǎng)特性上卻大不相同，大腸桿菌在普通瓊脂平板上短期培養(yǎng)即長出茂盛菌落，在麥康凱瓊脂平板上生長較好，能使較多的生化試驗起陽性反應(yīng)。鴨疫里默氏桿菌在普通瓊脂上幾乎不生長，在麥康凱瓊脂上不生長，大部分糖、醇發(fā)酵試驗陰性[9]。在臨床診斷工作中，當(dāng)病鴨病變特征為典型纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎時，獸醫(yī)人員常誤診為單純的大腸桿菌感染，而且因條件所限也常常只進行大腸桿菌的細菌分離鑒定和藥敏試驗，如果用藥4～5 d后病情仍得不到有效控制時，就必須考慮鴨群中有傳染性漿膜炎感染的存在，此時不能亂用藥，以免加重病情。鴨群發(fā)病初期同時進行兩種病原菌的分離鑒定和藥敏試驗，然后根據(jù)藥敏結(jié)果選用合適的敏感藥物進行5～10 d連續(xù)綜合治療，才能獲得比較理想的治療效果。

（4）鴨疫里默氏桿菌對生長條件要求較高，普通培養(yǎng)和保存不可靠，且到目前為止，對本菌保存條件和方法的分流研究較缺乏，這給本病的研究和實際生產(chǎn)帶來不便。在本次實驗中發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏桿菌在厭氧培養(yǎng)中生長較旺盛，有氧條件下亦可生長，但長勢較差。在厭氧培養(yǎng)時可以先讓蠟燭在缸中燃燒幾分鐘，燭缸蓋暫不蓋嚴(yán)，保持半通氣狀態(tài)，幾分鐘后再蓋緊，讓蠟燭燒盡，這樣可以使缸內(nèi)CO2濃度增加，提高菌落長出率[10]。呂殿紅將帶菌鴨血抗凝于-20℃冰箱中保存，鴨疫里默氏桿菌的活力可保持17個月以上，但認(rèn)為不利純化保存，易發(fā)生污染。實驗室保存菌種常用的是繼代保存，經(jīng)常是選用對被保存細菌最適宜的培養(yǎng)基。按常規(guī)法接種培養(yǎng)保存，可隨時復(fù)蘇，以供需要，簡易便行，但較費時。由于此法保存的時間不長需要不斷的繼代，增加了菌種受污染的機會。

（5）要重視免疫接種和藥物預(yù)防相結(jié)合。近幾年來我國養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展較快，鴨病也越來越多，再加上大量使用抗生素，使很多細菌、病毒產(chǎn)生了抗藥性，發(fā)病后治療效果不理想。因此，必須堅持“預(yù)防為主，防重于治”的方針，雛鴨8日齡皮下注射鴨疫里默氏桿菌滅活苗1 ml，第3周齡再加強免疫一次，或4日齡皮下注射鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌二聯(lián)滅活菌。此外，做好消毒隔離工作，降低飼養(yǎng)密度，減少應(yīng)激（如冷天鴨群避免淋雨）和外傷也會減少本病發(fā)生的機會[11]。

[1] 洪 冰，王志河，王洪芳.蛋鴨傳染性漿膜炎的診治[J].水禽世界，2006，（3）：34-35

[2] 卡爾尼克B W.禽病學(xué) [M]. 10版. 高 福，蘇敬良，譯. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：195-200

[3] 羅冬生，楊 鷹.小鴨傳染性漿膜炎的疹治[J].中國獸醫(yī)雜志，1998，24（9）：23-24

[4] 鄧治邦，朱深海，楊麗君，等. 鴨傳染性漿膜炎實驗性感染方法的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000，22（5）：343-344

[5] 朱芝秀，鄧舜洲，葉林方，等.17株鴨疫里氏桿菌的微生物學(xué)特性[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，（2）：212-215

[6] 張大丙，郭玉璞.不同血清型鴨疫里氏桿菌分離株的生化特性比較[J].中國獸醫(yī)雜志，1999，2（5）：13-15

[7] 濯新國，孟志敏.鴨疫里默氏桿菌的分離、鑒定及防治研究[J].邯鄲農(nóng)業(yè)高等專科學(xué)校學(xué)報，2000.17（2）：4-6

[8] 張大丙，郭玉璞.不同血清型鴨疫里氏桿菌分離株的部分特性比較[J].中國獸醫(yī)雜志，1999，（10）：13-15

[9] 莊祥弟，王美娟，施明軍，等.鴨傳染性漿膜炎防治藥物的篩選和應(yīng)用[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2002，（6）：19

[10] 鄧治邦，朱深海，楊麗君，等.鴨傳染性漿膜炎實驗性感染方法的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000，22（5）：343-344

[11] 洪冰，王志河，王洪芳.蛋鴨傳染性漿膜炎的診治[J].水禽世界，2006，（3）：34-35