林 立 孔繁德

（廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局，廈門(mén) 361012）

牛地方流行性白血?。‥BL），又稱牛病毒性造血細(xì)胞組織增生癥、牛淋巴肉瘤、牛惡性淋巴瘤、牛白血病復(fù)合癥等，該病是由牛白血病病毒（BLV）引起的牛的一種慢性腫瘤性疾病，該病毒屬于C型致瘤病毒屬，反轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae）致瘤病毒亞科（Oncoviridae）的RNA病毒，含單股RNA，該屬病毒與C型病毒的形態(tài)和裝配方式十分相似。BLV呈球狀，少數(shù)棒狀，大小不一，平均直徑80～100 nm，有囊膜，囊膜上有纖突。核衣殼呈20面體對(duì)稱，內(nèi)為螺旋狀結(jié)構(gòu)的類核體，核內(nèi)攜帶反轉(zhuǎn)錄酶。此病毒的結(jié)構(gòu)蛋白已知有幾種，但主要的是芯髓和囊膜，其中芯髓含有能抵抗乙醚的分子量為2.1萬(wàn)～2.5萬(wàn)個(gè)的編碼（P）蛋白質(zhì)，主要有P10、P12、P15、P19、P24、P53和P80；囊膜含有對(duì)乙醚有感受性的糖蛋白（稱為gp），主要有g(shù)p35、gp45、gp51、gp55、gp60和gp69等[1，2]。在這些蛋白中以gp51和P24的抗原活性最高，用這2種蛋白作為抗原進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)，可以檢出特異性抗體。

該病特征為淋巴樣細(xì)胞惡性增生、進(jìn)行性惡病質(zhì)和發(fā)病后的高死亡率。該病最早在1878年由德國(guó)首次報(bào)道，但直到l969年才由美國(guó)的Miller從病牛外周血液淋巴細(xì)胞中分離到病毒。此病在我國(guó)于1974年首次發(fā)現(xiàn)于上海，此后逐步蔓延到全國(guó)其他省市?，F(xiàn)在，該病已成為牛的重要傳染病之一，而且具有進(jìn)一步蔓延，甚至死灰復(fù)燃的趨勢(shì)。例如，芬蘭自1996年以來(lái)從未發(fā)現(xiàn)BLV病例，1999年芬蘭宣布全國(guó)消滅BLV。但是，在2008年4月2日，芬蘭農(nóng)林部向OIE報(bào)告了新的BLV疫情通告[3]。因此，為了有效控制BLV的發(fā)生、發(fā)展，有必要對(duì)其最新的診j技術(shù)進(jìn)一步了解。本文將從BLV的流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化、臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)幾個(gè)角度，較為全面的綜述該病研究進(jìn)展情況。

1 流行病學(xué)

感染病牛終生帶毒，成為傳染源。BLV的傳播方式有垂直傳染和水平傳染2種[2，3]。前者包括先天性傳染，母牛通過(guò)子宮胎盤(pán)將病毒傳遞給胎兒或通過(guò)胚胎移植傳播病毒，這種感染可能發(fā)生在免疫力建立之前。犢牛在出生后食初乳之前，體內(nèi)已有病毒和相應(yīng)的抗體；后者則可能通過(guò)血源性傳播（如由病毒污染的器械、獸醫(yī)采血、注射、手術(shù)等）、分泌物性傳播（如鼻腔分泌物、唾液、支氣管-肺泡洗出液、尿液、糞便、子宮沖洗液和精液等）、接觸性傳播（該種傳播實(shí)際上多是媒介的傳播）、寄生昆蟲(chóng)的傳播（寄生昆蟲(chóng)在吮吸病牛血后，很有可能將感染的淋巴細(xì)胞傳播到其他的健康牛）、精液性傳播（如人工輸精，但精源性傳播在BLV的感染中機(jī)會(huì)很?。?，生物制劑的應(yīng)用、新生犢牛吃病母牛的初乳、常乳及其制品等，也可傳染發(fā)病。

2 臨床癥狀

Bendixen（1965）曾以臨床病理學(xué)方法將牛白血病分為地方流行型牛白血?。ǔ膳Ｐ桶籽。┖蜕l(fā)型牛白血?。倥Ｐ?、胸腺型和皮膚型）。因此，根據(jù)臨床病理學(xué)變化，將臨床癥狀分為以下幾型[4]：

2.1 地方流行型

以4～8歲奶牛多發(fā)。多數(shù)感染牛不呈現(xiàn)臨床癥狀，以在血液中存有白血病抗體并出現(xiàn)持續(xù)的淋巴細(xì)胞增多癥和異常淋巴細(xì)胞為特征。只有生成腫瘤之后，才出現(xiàn)體表或頸淺淋巴結(jié)及內(nèi)臟淋巴結(jié)腫大。直腸檢查可觸摸到腫大的內(nèi)臟淋巴結(jié)。由于腫瘤部位機(jī)械性損傷和壓迫作用，使病牛呈現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀。病牛食欲不振，體重減輕，發(fā)育不良，全身乏力，泌乳性能明顯降低，可視粘膜蒼白或黃染，前胃馳緩和瘤胃臌氣等。當(dāng)侵害心臟時(shí)，心搏動(dòng)亢進(jìn)，心跳加快，心音異常，出現(xiàn)瘤塊壓迫性呼吸、吞咽困難，全身出汗，眼球突出，胸前浮腫，腹瀉，糞如泥樣，有惡臭味，混有血液，尿頻或排尿困難。當(dāng)骨盆腔及后腹部發(fā)生腫瘤時(shí)，病牛呈現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)，跛行。起立困難，被迫橫臥地上。子宮腫瘤病牛，發(fā)生流產(chǎn)、難產(chǎn)或?qū)遗洳辉小?/p>

2.2 犢牛型

常見(jiàn)于6個(gè)月齡以內(nèi)的犢牛或青年牛。淋巴結(jié)腫大，精神不振，全身虛弱無(wú)力，個(gè)別的病牛發(fā)熱，心動(dòng)過(guò)速，可視粘膜發(fā)紺或黃染。食欲不振，全身出汗，腹瀉，駐立困難而臥地。由于內(nèi)臟發(fā)生的瘤塊壓迫，呈現(xiàn)瘤胃臌氣和充血性心力衰竭等癥狀。

2.3 胸腺型

以7～24個(gè)月齡以內(nèi)的小牛多發(fā)。胸腺呈塊狀腫大，其鄰近局部淋巴結(jié)被侵害、腫大，引起頸靜脈怒張、靜脈波動(dòng)和局部浮腫。有的出現(xiàn)發(fā)熱、瘤胃臌氣等癥狀。

2.4 皮膚型

幼齡牛皮膚出現(xiàn)蕁麻疹樣皮疹，以真皮層為主形成肉瘤。成年牛常于頸、背、臀及大腿等處發(fā)生腫塊。

3 病理變化

3.1 病理組織學(xué)檢測(cè)

將陽(yáng)性牛進(jìn)行病理剖檢，采取淋巴結(jié)、胸骨、心、肺、肝、腎、脾、胃腸等器官和肌肉，用10%的福爾馬林、酒精、AF等固定液固定，石蠟包埋切至3～4 μm和6～8 μm，同一組織塊制成3張切片，分別以H·E染色、PTAH、Lordonit網(wǎng)狀纖維、Van Gesonit膠原纖維染色，對(duì)比觀察組織學(xué)變化。結(jié)果表明，病牛淋巴結(jié)腫大，遍及全身和各臟器，形成大小不等的結(jié)節(jié)性或彌漫性肉芽腫病灶，尤其真胃、心臟和子宮等為最常發(fā)的器官[4]，同時(shí)容易誘發(fā)機(jī)會(huì)性感染。

3.2 病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)

病理形態(tài)學(xué)方法主要檢查淋巴結(jié)、脾、骨髓以及肝、腎、心肌等變化，可發(fā)現(xiàn)持續(xù)性的淋巴細(xì)胞惡性增生，并形成肉眼可見(jiàn)的淋巴細(xì)胞肉瘤。

4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

4.1 血液學(xué)檢測(cè)

血液學(xué)方法是以檢查外周血液中白細(xì)胞數(shù)增多為基礎(chǔ)。一般間隔2～3月進(jìn)行1次補(bǔ)充的血液學(xué)分析，直到獲得連續(xù)2次相同的位于正常血液學(xué)數(shù)據(jù)的結(jié)果為止。國(guó)際上一般采用Bendixen氏檢索表進(jìn)行BL牛血液學(xué)檢查。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、上海獸醫(yī)研究所、哈爾濱獸醫(yī)研究所等根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r和血檢診斷BL時(shí)除了要看淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的增多變化，還必須看是否出現(xiàn)成淋巴細(xì)胞或前淋巴細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞及核分裂等現(xiàn)象綜合評(píng)定。

4.2 血清學(xué)檢測(cè)

血清學(xué)方法主要以免疫瓊脂擴(kuò)散檢測(cè)（AGID）BLV沉淀抗體，此抗體能在感染后2個(gè)月出現(xiàn)，并保留終身。其他的方法主要包括免疫熒光抗體法、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫測(cè)定法、血凝試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、對(duì)流免疫電泳技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、親合素－生物素過(guò)氧化物酶系統(tǒng)測(cè)定等方法。若檢出白血病抗體，即可確診為病毒感染。

4.2.1 單克隆抗體技術(shù)（McAb）

單克隆抗體技術(shù)主要是用來(lái)檢測(cè)BLV抗原。相較抗原的其他幾種檢測(cè)方法，例如依靠電子顯微鏡或免疫電鏡技術(shù)，由于BLV在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制量有限，往往很難觀察到病毒粒子，而逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定，由于操作繁瑣，要求條件高，特異性較差，也很難推廣應(yīng)用，所以基于單克隆抗體（MAB）的相關(guān)技術(shù)得到了發(fā)展。趙化民等應(yīng)用抗BLV糖蛋白（gp）抗原MAB探針，采用抗原捕獲試驗(yàn)（MABACA）檢測(cè)BLV抗原，并與AGID和ELISA比較，結(jié)果表明MAB-ACA的敏感性顯著高于AGID技術(shù)，特異性明顯高于ELISA，而且該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性好，在BLV抗原檢測(cè)方面有著一定的優(yōu)勢(shì)[5]。

4.2.2 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）

采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)血清主要針對(duì)的是抗gp51和p24抗體。間接法是先將提純的抗原包被到固相載體，再加試驗(yàn)血清和特異性lgG結(jié)合物；阻斷法是利用試驗(yàn)血清中的抗體干擾或阻斷標(biāo)準(zhǔn)抗原-抗體反應(yīng)。Gutierrez等[6]研制了一種新的阻斷ELISA，該方法以gp51為抗原，對(duì)牛血清和乳樣品中BLV抗體的檢測(cè)具有特異和敏感的特點(diǎn)。趙顯文等用免疫親和層析提純技術(shù)獲取高純度的BLV抗原，建立一種快速特異的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA），用于檢測(cè)BLV血清抗體。其檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性者完全覆蓋并高于ID試驗(yàn)的檢出率，與ELISA法測(cè)得陽(yáng)性結(jié)果完全符合。該法比ID試驗(yàn)高5.6%，并可提前60多個(gè)小時(shí)報(bào)告結(jié)果；比ELISA法亦可提前10幾個(gè)小時(shí)得出結(jié)果。該法不需要特殊儀器設(shè)備，是一種特異性強(qiáng)，敏感性良好而且快速的免疫學(xué)檢測(cè)方法[7]。目前，關(guān)于牛白血病ELISA檢測(cè)試劑盒的研究與開(kāi)發(fā)也得到了進(jìn)一步的推廣與應(yīng)用[8]。

4.3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

目前，分子生物學(xué)檢測(cè)方法由于具有高度敏感的特點(diǎn)，在病原檢測(cè)里面占據(jù)重要地位。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是比較靈敏的直接檢測(cè)BLV前病毒的方法之一。Naif等[9]采用PCR檢測(cè)BLV，可從感染宿主檢測(cè)到100 ng前病毒DNA，使本試驗(yàn)的敏感性提高了2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)數(shù)，而且，無(wú)論是在淋巴細(xì)胞還是在腫瘤細(xì)胞，以及各個(gè)感染時(shí)期都可檢出前病毒DNA。Agresti等[10]應(yīng)用PCR診斷初生牛犢BLV，DNA擴(kuò)增靶物采用BLV前病毒基因組中位于gag和env基因區(qū)的2個(gè)片斷（分別為277 bp和220 bp），參照BLV前病毒核苷酸序列設(shè)計(jì)合成寡核苷酸引物（20 bp）和雜交探針（29 bp），進(jìn)行PCR試驗(yàn)。結(jié)果表明，PCR技術(shù)診斷犢牛出生前后感染BLV是可靠的。其他的一些新型PCR技術(shù)也得到了開(kāi)發(fā)。例如，巢式PCR（Nested PCR），利用2套PCR引物（巢式引物）進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性（因?yàn)榕c2套引物都互補(bǔ)的模板很少）增加了檢測(cè)的敏感性；同時(shí)2對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)，增加了檢測(cè)的可靠性。該方法能從兩個(gè)BAT-BLV細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)出BLV的前病毒DNA形式[11]。劉志玲等[12]采用LUXTM新型熒光PCR技術(shù)原理，設(shè)計(jì)并合成1對(duì)單標(biāo)記LUXTM熒光引物，建立了LUXTM熒光PCR和RT-PCR方法，可快速檢測(cè)BLV前病毒DNA和病毒RNA。敏感性實(shí)驗(yàn)表明，LUXTM熒光RT-PCR對(duì)RNA前病毒的檢測(cè)敏感性達(dá)0.49 ng/μL，熒光PCR對(duì)pTblv-gp51重組質(zhì)粒的檢測(cè)敏感性可達(dá)0.138拷貝，比OIE規(guī)程的巢式，PCR方法高104倍以上。

4.4 其他

血液學(xué)、血清學(xué)、病理形態(tài)學(xué)以及組織學(xué)檢測(cè)除了以上常規(guī)操作外，還存在一些其他的診斷檢測(cè)手段，現(xiàn)分述如下：

4.4.1 色氨酸代謝

謝占武等人探討了地方流行性牛白血病與色氨酸（Trp）代謝的關(guān)系。結(jié)果表明，經(jīng)熒光法測(cè)定瓊擴(kuò)陽(yáng)性牛、羊血清和牛奶中的Trp含量明顯高于瓊擴(kuò)陰性對(duì)照組，此結(jié)果與原蘇聯(lián)學(xué)者的報(bào)道一致，表明可采用此法作為生前診斷BLV的一種生化指標(biāo)。由于該法檢測(cè)用量少，操作簡(jiǎn)單，只要有熒光分光光度計(jì)即可應(yīng)用，3 h內(nèi)即可得出準(zhǔn)確結(jié)果[13]。

4.4.2 膠體金免疫層析法

宋陽(yáng)威等以膠體金標(biāo)記的羊抗牛IgG（Fc）抗體作為標(biāo)記抗體，將純化的His-gp51重組蛋白和羊抗牛IgG分別標(biāo)記于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，各部件按序裝配形成快速診斷試紙條。對(duì)22份樣本分別用試紙條和ELISA試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，2種方法的陽(yáng)性符合率為88.9%（8/9），表明該研究建立的膠體金免疫層析方法簡(jiǎn)便、快捷，具有較好的特異性和一定的敏感性，適宜基層初篩診斷和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用[14]。

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