彭亞鴿

(寧夏大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

適體是利用SELEX體外篩選技術(shù)從核酸分子文庫(kù)中獲得的單鏈DNA或RNA。適體能與氨基酸、蛋白、藥物、有機(jī)小分子、無(wú)機(jī)離子等靶物質(zhì)特異性、高選擇性結(jié)合［1，2］。適體作為分子識(shí)別物質(zhì)，比大分子的抗體相比較，不僅具有分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能保證合成的精確性及易連接其它分子進(jìn)行修飾等優(yōu)點(diǎn)，而且還可以變性、復(fù)性且速度快，可反復(fù)使用、長(zhǎng)期保存［3，4］。基于適體的這些優(yōu)點(diǎn)，將適體作為生物傳感器的識(shí)別元件，制成的適體生物傳感器，具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。適體生物傳感器在蛋白質(zhì)與DNA的相互作用、藥物檢測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷和治療、分子開關(guān)等方面得到廣泛應(yīng)用［5－7］。非標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器以其簡(jiǎn)單、靈敏而倍受研究者的青睞。電化學(xué)交流阻抗技術(shù)是一種對(duì)電極界面性質(zhì)變化十分敏感而便捷的檢測(cè)技術(shù)，能夠提供有關(guān)電極界面電子傳遞電阻，雙電層電容等多種界面參數(shù)的大量信息。因此，電化學(xué)交流阻抗技術(shù)己被廣泛應(yīng)用于研究電化學(xué)反應(yīng)過程及電極界面性質(zhì)變化［8，9］。

凝血酶(Thrombin)是由39個(gè)氨基酸殘基的輕鏈和259個(gè)氨基酸殘基的重鏈組成的絲氨酸蛋白水解酶［10］。凝血酶的濃度及活性是衡量凝血機(jī)制的重要指標(biāo)，對(duì)揭示腫瘤的發(fā)生機(jī)制，腫瘤細(xì)胞的早期診斷、療效及預(yù)后判斷等具有重大意義［11］。利用凝血酶適體設(shè)計(jì)檢測(cè)凝血酶的電化學(xué)適體傳感器近年來得到了研究者的關(guān)注［12－14］。但是連接臂的不同對(duì)適體與凝血酶之間的結(jié)合能力有比較大的影響。因此，本研究擬以三條連接臂長(zhǎng)度不同的凝血酶適體作為識(shí)別分子，將其自組裝于金電極上，以凝血酶為研究對(duì)象，結(jié)合巰基自組裝技術(shù)，利用電化學(xué)交流阻抗技術(shù)，研究了連接臂對(duì)適體與凝血酶相互作用的影響，以期獲得理想的凝血酶適體。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

電化學(xué)測(cè)量系統(tǒng)為CHI 660電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)。實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)，組裝適體傳感器或金電極(φ=2 mm)作為工作電極，鉑絲作為對(duì)極，Ag/AgCl(飽和KCl)作為參比電極。電化學(xué)阻抗法(Electrochemical Impedance Spectroscopy，EIS)使用CHI660電化學(xué)工作站。所有電位均以該參比電極電位為標(biāo)準(zhǔn)。

巰基己醇(MCH，97%)、Tween－20均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。凝血酶(Human－thrombin Mw=36700 g/mol，pI=7.0～7.6)購(gòu)自上海 Haematologic公司。鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀購(gòu)自于上?；瘜W(xué)試劑廠。所有試劑均為分析純。所有儲(chǔ)備液和緩沖溶液均使用二次去離子超純水(France)配制。0.10 mol/LPBS磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)、固定結(jié)合緩沖液(Immobilization－Binding Buffer，I－B 緩沖溶液)為0.10 mol/L磷酸緩沖溶液(PB，pH=7.00包含10 mmol/L KCl和2 mmol/L MgCl2)、檢測(cè)溶液為0.10 mol/L PBS(pH=7.40，包含 10 mmol/L NaCl，10 mmol/LK3［Fe(CN)6］－ 10 mmol/LK4［Fe(CN)6］)。凝血酶適體(Thrimbin－Binding Aptamer)購(gòu)自上海生物工程公司。

表1 凝血酶適體序列

1.2 電化學(xué)適體傳感器的制備

金電極的預(yù)處理:先將金電極浸泡在Piranha溶液中(30%H2O2∶濃 H2SO4=1∶3 v/v)5 min，取出后用二次水沖洗干凈;隨后用0.03·μmAl2O3溶膠研磨，然后依次分別用乙醇、二次水超聲清洗;再將金電極在0.1 mol/L H2SO4溶液中在電位范圍－0.2～1.5 V循環(huán)伏安掃描直到得到標(biāo)準(zhǔn)金的還原峰，用二次水沖洗。微量移液器將20 μL預(yù)處理后(90℃水浴加熱180 s，然后冰浴中迅速冷卻，以獲得適體的折疊結(jié)構(gòu))的適體溶液仔細(xì)滴涂在處理過的金電極表面(為了避免溶液蒸發(fā)使用合適的塑料帽覆蓋電極表面)，室溫下靜置適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，電極表面用水沖洗;然后用2.0 μL 1.0×10－3mol/L巰基己醇(MCH)封閉30 min，以封閉電極表面沒有被適體占據(jù)的空白位點(diǎn)，防止電極表面的非特異性吸附。封閉結(jié)束用沖洗緩沖溶液沖洗，得到本工作中的凝血酶適體傳感器。

1.3 電化學(xué)測(cè)量方法

將適體傳感器浸入100 μL一定濃度的凝血酶溶液中，室溫下放置適當(dāng)時(shí)間后，傳感器用大量水沖洗以移走吸附的凝血酶，然后傳感器置于含有2.0 mL0.10 mol/LPBS －10 mmol/LK4［Fe(CN)6］－ 10 mmol/LK3［Fe(CN)6］ － 10 mmol/L NaCl(pH=7.40)溶液的電化學(xué)池中進(jìn)行電化學(xué)阻抗(EIS)測(cè)定。EIS 測(cè)定的偏電位0.226 V，通過［Fe(CN)6］3－/4－平衡電對(duì)的式電位來決定，頻率范圍100 kHz～1.0 Hz，每10倍頻采12個(gè)點(diǎn)，振幅為5.0 mV。以電子傳遞電阻△Ret為分析信號(hào)，對(duì)凝血酶進(jìn)行定量測(cè)定。如果沒有特殊說明，電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行(25±1℃)。

2 結(jié)果與討論

2.1 電化學(xué)適體傳感器的表征

采用電化學(xué)阻抗法對(duì)適體傳感器進(jìn)行表征。圖1 為裸金電極(曲線 1)，固定 5＇－C6－T5－A1 鏈的金電極(曲線2)，組裝的適體傳感器(曲線3)，適體傳感器與凝血酶相互作用50 min后獲得的法拉第阻抗圖譜(曲線4)。從圖1可以看出，裸金電極幾乎為一直線，［Fe(CN)6］3－/4－向電極的表面的擴(kuò)散不存在阻礙。當(dāng) 5＇－C6－T5－A1 鏈固定在金電極表面上后，阻抗圖譜上高頻區(qū)半圓直徑大大增加，電子傳遞電阻 Ret增大，這是由于 5＇－C6－T5－A1 鏈磷酸骨架上帶的負(fù)電荷排斥帶負(fù)電荷的［Fe(CN)6］3－/4－平衡電對(duì)，阻礙平衡電對(duì)向電極表面?zhèn)鬟f，使電極表面電子傳遞電阻 Ret增大，說明 5＇－C6－T5－A1 鏈已經(jīng)成功的固定在金電極表面。組裝好的傳感器用巰基已醇(MCH)封閉后，電極在高頻區(qū)半圓繼續(xù)增大，原因是MCH為短鏈的巰基分子，它可以有效地占據(jù)沒有被適體占據(jù)的電極表面的空白位點(diǎn)，減少電極表面非特異性吸附。同時(shí)也說明［Fe(CN)6］3－/4－在電極上的電子傳遞更困難。當(dāng)適體傳感器結(jié)合凝血酶分子50 min后，阻抗圖譜上表現(xiàn)為高頻區(qū)半圓繼續(xù)增大，表明適體傳感器與凝血酶結(jié)合，使得［Fe(CN)6］3－/4－平衡電對(duì)在電極上的電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)越小，傳感器上電子傳遞電阻Ret顯著增大。因此，可以使用交流阻抗法對(duì)凝血酶進(jìn)行測(cè)定。

2.2 適體傳感器測(cè)量條件優(yōu)化

2.2.1 自組裝時(shí)間優(yōu)化

圖1 適體傳感器在［Fe(CN)6］3－/4－溶液中的交流阻抗圖

考察了不同適體鏈固定時(shí)間對(duì)電子傳遞電阻Ret的影響。以 5＇－C6－T5－A1 鏈為例，結(jié)果表明，電子傳遞電阻 Ret隨 5＇－C6－T5－A1 鏈固定時(shí)間增長(zhǎng)而明顯增加，當(dāng)固定時(shí)間為5.0 h時(shí)，Ret達(dá)到穩(wěn)定值。這表明在金電極表面的 5＇－C6－T5－A1 的固定量，隨著固定時(shí)間的增加慢慢達(dá)到飽和。固定時(shí)間為6.0～8.0時(shí)，Ret幾乎與5.0 h時(shí)的Ret值相等。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇凝血酶適體的固定時(shí)間為6.0 h。

2.2.2 適體傳感器與凝血酶相互作用時(shí)間優(yōu)化

考察了凝血酶與適體傳感器相互作用時(shí)間對(duì)傳感器響應(yīng)信號(hào)△Ret的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相互作用時(shí)間在5～40 min之間增加時(shí)，△Ret顯著增加，40 min時(shí)△Ret達(dá)到穩(wěn)定值，40～60 min之間，△Ret變化不大，說明40 min相互作用時(shí)間足夠凝血酶與適體的結(jié)合，為了保證適體與凝血酶的完全結(jié)合，在隨后實(shí)驗(yàn)中選擇適體傳感器與凝血酶相互作用時(shí)間為50 min。

2.3 三條適體鏈結(jié)合反應(yīng)的線性范圍和檢出限

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，將三條不同長(zhǎng)度連接臂修飾的凝血酶適體組裝的電化學(xué)適體傳感器對(duì)凝血酶進(jìn)行測(cè)定。圖 2 為 5＇－C6－T0－A1 組裝適體傳感器對(duì)不同濃度(0.1～8.0 nmol/L)凝血酶測(cè)定的交流阻抗圖。內(nèi)插圖為△Ret隨凝血酶濃度變化圖。從內(nèi)插圖可以看出△Ret與凝血酶的濃度在0.1～0.8 nmol/L之間呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為△Ret=1363.1 c－78.51(c/nmol/L)，R2=0.9845。檢出限0.05 nmol/L。

圖2 5＇－C6－T0－A1電化學(xué)適體傳感器的復(fù)平面阻抗圖及其線性關(guān)

圖 3 為 5＇－C6－T5－A1 組裝適體傳感器對(duì)不同濃度(0.1～8 nmol/L)凝血酶測(cè)定的交流阻抗圖。內(nèi)插圖為△Ret隨凝血酶濃度變化圖。從內(nèi)插圖可以看出△Ret與凝血酶的濃度在0.1－1.0 nmol/L之間呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔRet=67.12+1719.4 c(c/nmol/L)，R2=0.9923。檢出限為0.07 nmol/L。

圖 3 5＇－C6－T5－A1 電化學(xué)適體傳感器的復(fù)平面阻抗圖及其線性關(guān)系

圖 4 為 5＇－C6－T10－A1組裝適體傳感器對(duì)不同濃度(0.1～8 nmol/L)凝血酶測(cè)定的交流阻抗圖。內(nèi)插圖為△Ret隨凝血酶濃度變化圖。從內(nèi)插圖可以看出△Ret與凝血酶的濃度在0.1～0.8 nmol/L之間呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為△Ret=395.29+1618.8 c(c/nmol/L)，R2=0.9982。檢出限為0.05 nmol/L。

比較3種傳感器的線性回歸方程的斜率，其靈敏度為 5＇－C6－T5－A1 ＞ 5＇－C6－T10－A1 ＞ 5＇－C6－T0－A1 ＞5＇－C6－T20－A1。3 種傳感器的靈敏度區(qū)別可能是由于不同的適體與凝血酶結(jié)合能力有差異引起的。

圖 4 5＇－C6－T10－A1 電化學(xué)適體傳感器的復(fù)平面阻抗圖及其線性關(guān)系

圖 5 Ret/Ret，0 與(A)5＇－C6－T0－A1，(B)5＇－C6－T5－A1and(C)5＇－C6－T10－A1 的線性關(guān)系

2.4 適體與凝血酶結(jié)合常數(shù)的測(cè)定

根據(jù) Szymánska等［16］報(bào)道利用電化學(xué)交流阻抗法檢測(cè)免疫反應(yīng)的平衡常數(shù)。利用交流阻抗法測(cè)定了3種凝血酶適體與凝血酶的結(jié)合常數(shù)。以△Ret/Ret，0對(duì)凝血酶濃度c作圖，得到一條直線，根據(jù)直線斜率，可以計(jì)算出適體與凝血酶的結(jié)合常數(shù)Ka。由圖5可知，3條鏈的結(jié)合常數(shù)Ka分別為0.32 nM－1，0.84 nM－1，0.67 nM－1，5＇－C6－T5－A1 ＞ 5＇－C6－T10－A1 ＞5＇－C6－T0－A1。文獻(xiàn)里曾有報(bào)道隨著連接臂的增加自組裝單層的適體傳感器表面密度逐漸降低［15］。分析其原因，從 5＇－C6－T0－A1 到 5＇－C6－T5－A1結(jié)合常數(shù)增加，是由于凝血酶有更多機(jī)會(huì)與適體結(jié)合。而隨著胸腺嘧啶連接臂長(zhǎng)度的增加，結(jié)合能力整體有所下降，是因?yàn)檫m體的表面密度逐漸降低和連接臂的空間位阻加大所致。最終由于適體鏈變長(zhǎng)，導(dǎo)致凝血酶距離電極越遠(yuǎn)，使得電子傳遞效率更加困難。

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)了連接臂長(zhǎng)度逐漸增加的適體鏈5＇－C6－T0－A1、5＇－C6－T5－A1 和 5＇－C6－T10－A1，將其自組裝于金電極上構(gòu)成電化學(xué)適體傳感器，利用交流阻抗技術(shù)，分別以這3種適體為識(shí)別分子測(cè)定凝血酶的線性范圍和檢出限，比較了三者靈敏度的差異。利用濃度平衡法計(jì)算了適體與凝血酶形成的結(jié)合常數(shù)。并通過動(dòng)力學(xué)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5＇－C6－T5－A1組裝的傳感器靈敏度最好，與凝血酶的結(jié)合常數(shù)最大。本研究對(duì)適體－目標(biāo)蛋白質(zhì)之間結(jié)合過程的機(jī)理有一個(gè)更深的理解，將有助于我們進(jìn)一步揭示核酸與蛋白這兩種生命中最關(guān)鍵物質(zhì)之間的相互作用和關(guān)系，對(duì)于我們更好地理解基本的生物過程和預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)適體生物檢測(cè)方法，發(fā)展用于疾病診斷的方法有著重要的意義。

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