高月娟 譚思思 王景欣

（牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院·157011）

通脈平膠囊是由黃芪、丹參、肉桂、黨參、玄參、金銀花等組成，具有抗炎、提高毛細(xì)血管通透性作用，用于治療血栓閉塞性脈管炎。方中肉桂含有揮發(fā)油，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選揮發(fā)油提取工藝并進(jìn)一步采用包合技術(shù)對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合，旨在降低揮發(fā)油損失，增強(qiáng)療效。有文獻(xiàn)報(bào)道[1]，采用包合技術(shù)，使揮發(fā)油包裹到β-CD形成的空腔結(jié)構(gòu)中，使液體藥物實(shí)現(xiàn)固體粉末化，可避免揮發(fā)油在貯藏時(shí)揮發(fā)，保證藥品質(zhì)量及臨床療效，并減少揮發(fā)油在生產(chǎn)、儲(chǔ)存過(guò)程中揮散和氧化變質(zhì)，從而提高了制劑的穩(wěn)定性。

1 藥品、輔料和儀器

藥品：肉桂飲片購(gòu)于安國(guó)市醫(yī)藥有限責(zé)任公司。經(jīng)鑒定符合2010版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定。

輔料：β-CD（β～環(huán)糊精）天津市科密化學(xué)試劑有限公司，純度≥99%，符合2010版《中國(guó)藥典》二部標(biāo)準(zhǔn)。

儀器：BSA224S－CW電子分析天平（萬(wàn)分之一，上海梅特勒－托利多公司）；UV－160A紫外/可見(jiàn)分光光度儀（日本島津）；XL－03－04XL84－Ⅱ磁力攪拌器；揮發(fā)油提取器（比重大于1型），符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2 揮發(fā)油的提取方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)有關(guān)資料和預(yù)實(shí)驗(yàn)，以水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，采用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選擇浸泡時(shí)間（A）、提取時(shí)間（B）、加水量（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平的試驗(yàn)方案。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

稱(chēng)取肉桂300g，平行九份。按上述因素水平采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，收集揮發(fā)油，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以揮發(fā)油體積為試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行直觀分析、方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 方差分析表

根據(jù)表3方差分析結(jié)果，對(duì)揮發(fā)油提取結(jié)果進(jìn)行直觀分析，比較4個(gè)數(shù)的極差，RA＞RB＞RC＞RD，故影響因素的大小順序?yàn)锳＞B＞C＞D。由上述方差分析結(jié)果可知，因素A、B各水平間有顯著性差異（F＞19），再結(jié)合揮發(fā)油各水平含量及實(shí)際生產(chǎn)，優(yōu)選最佳提取工藝為A2B1C2，即藥材加8倍量水浸泡1小時(shí)，蒸餾提取6小時(shí)。

3 揮發(fā)油包合工藝方法與結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)方法

用研磨法制備揮發(fā)油β-CD包合物，采用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素和水平見(jiàn)表1，其方法為在一定的實(shí)驗(yàn)溫度下，將β-CD加適量蒸餾水研勻后，精密吸量取1.00ml揮發(fā)油，取揮發(fā)油，用乙醇（1：2）稀釋?zhuān)诰芊Q(chēng)取β-CD置研缽中，加入適量水，邊研磨邊用滴管將揮發(fā)油的乙醇稀釋液滴入β-CD與水的混合物中，快速研磨置規(guī)定時(shí)間，置冰箱適量冷藏24h，抽濾至干，依次用適量水及無(wú)水乙醇洗滌研缽和包合物，置無(wú)揮發(fā)油氣味，包合物（50℃）真空干燥4小時(shí)，得白色粉末狀物，稱(chēng)重，計(jì)算收率。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。

表4 因素水平表

3.2 包合率、包合物收率計(jì)算

取干燥包合物適量，精密稱(chēng)重，置裝有沸石的250ml燒瓶中，加蒸餾水200ml，按中國(guó)藥典2010年版一部附錄揮發(fā)油測(cè)定法提取揮發(fā)油，置油量不再增加時(shí)停止加熱，放置1小時(shí)，置油呈清亮淡黃色，稱(chēng)定揮發(fā)油重量，計(jì)算揮發(fā)油體積，按下式計(jì)算包合率、包合物收得率。

包合率=包合物量÷（β-CD+揮發(fā)油投入量）×100%

包合物得率=包合物中揮發(fā)油回收量÷（揮發(fā)油投入量×空白回收率）×100%

包合率為衡量包合效果的中藥指標(biāo)，揮發(fā)油利用率越高，包合效果越好，可作為包合工藝篩選的主要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定為0.7，但包合物收得率也有意義，越高，包合效果越好，因此，包合物收得率可作為次要篩選指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定為0.3，將二者進(jìn)行綜合評(píng)分。

包合率評(píng)分=揮發(fā)油利用率/最大揮發(fā)油包合率×0.7×100

包合物得率評(píng)分=包合物收率/最大揮發(fā)油收率值×0.3×100

綜合評(píng)分=包合率評(píng)分＋包合物得率評(píng)分

3.3 揮發(fā)油空白回收率的測(cè)定

于500ml蒸餾瓶中加入200ml蒸餾水和1ml揮發(fā)油，加熱提取揮發(fā)油至油量不在增加為止。結(jié)果得揮發(fā)油平均值為0.5012ml（n=3），按下式計(jì)算裝置的空白回收率：

空白回收率=實(shí)際測(cè)得揮發(fā)油量/蒸餾前投以油量×100%

經(jīng)3次測(cè)定，計(jì)算裝置的揮發(fā)油平均空白回收率為50.12%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以包合率、包合物得率為試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行直觀分析、方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6.

表6 方差分析

結(jié)果表明，影響包合效果的順序?yàn)棣?CD與油之比＞包合時(shí)間＞包合溫度，最佳包合工藝A2B3C1，即揮發(fā)油與β-CD比為1：8，包合溫度60℃，包合時(shí)間1小時(shí)。

3.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

3.4.1 最佳提取工藝的驗(yàn)證 取黃芪、丹參、肉桂、當(dāng)歸、川芎、黨參、玄參、金銀花等，按上述最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3），揮發(fā)油的得率最高，且工藝穩(wěn)定，故所選工藝技術(shù)條件A2B1C2是可行的。

3.4.2 最佳包合工藝的驗(yàn)證 取揮發(fā)油和乙醇（V：V=1：2），按上述最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3），揮發(fā)油得率最高，且工藝穩(wěn)定，故所選的工藝技術(shù)條件A2B3C1，是可行的。

3.4.3 包合物的質(zhì)量研究 取含揮發(fā)油的包合物與按制備方法制備的空白包合物（不加任何藥物）各少許于蓋玻片上，置光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果：空白包合物為規(guī)則的β－CD板狀結(jié)晶，含油的化合物為不規(guī)則形的粉末。證明揮發(fā)油與β－CD確以形成包合物。

4 β－CD包合物的紫外鑒別

采用紫外可見(jiàn)分光光度法，以吸收曲線(xiàn)和吸收峰的位置和高度來(lái)判斷包合物形成的情況。

儀器：島津UV～2550

測(cè)定條件：紫外掃描范圍200～400nm。

樣品1：精密吸取揮發(fā)油0.0625ml，置100ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

樣品2：精密稱(chēng)取β-CD0.5g，揮發(fā)油0.0625g，加乙醇40ml洗滌，濾過(guò)，濾液加乙醇定容至100ml，備用。

樣品3：精密稱(chēng)取β-CD揮發(fā)油包合物0.5g，加乙醇40ml回流提取30分鐘，濾過(guò)，濾液加乙醇定容至100ml，備用。

樣品4：精密稱(chēng)取β－CD揮發(fā)油包合物0.5g，加乙醇40ml洗滌，濾過(guò)，濾液加乙醇定容至100ml，備用。

樣品5：精密稱(chēng)取β－CD0.5g，加乙醇40ml回流提取30分鐘，濾過(guò)，濾液加乙醇定容至100毫升容量瓶，備用。

取上述樣品各1ml，分別稀釋至100ml，進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明：樣品1和樣品3紫外圖譜基本一致，說(shuō)明β～CD和揮發(fā)油形成的包合物并未改變主要成分的理化性質(zhì)；樣品1、樣品2和樣品4可知，β－CD與揮發(fā)油的紫外色譜峰面積相互疊加，峰面積增加；樣品4與樣品5紫外吸收光譜基本相同，表明包合物形成過(guò)程為一物理包合過(guò)程，未與β－CD發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，包合物基本形成。

5 討論

（1）本研究試驗(yàn)結(jié)果表明，揮發(fā)油與β－CD投料比的重要影響因素，有極顯著影響，而包合時(shí)間、包合溫度無(wú)顯著影響。按最佳工藝即揮發(fā)油與β－CD比為1：8，包合溫度60℃，包合時(shí)間1小時(shí)所得包合物經(jīng)處理采用紫外掃描鑒別，證明所得紫外掃描圖形成的吸收光譜與揮發(fā)油吸收光譜類(lèi)似，說(shuō)明包合物已形成。

（2）肉桂為通脈平膠囊處方中富含揮發(fā)油的藥味，經(jīng)過(guò)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其揮發(fā)油為發(fā)揮藥效的主要的物質(zhì)之一，故在進(jìn)行制劑工藝時(shí)，對(duì)以上3味提取藥材揮發(fā)油。結(jié)果表明：以飲片提取揮發(fā)油所得揮發(fā)油量較少，提取3小時(shí)后，即使提取時(shí)間在延長(zhǎng)，揮發(fā)油量也沒(méi)有明顯增加。但是如將粉碎成細(xì)粉，同法提取揮發(fā)油，揮發(fā)油得率明顯增加?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定，測(cè)定用的供試品須預(yù)先粉碎，使能通過(guò)二至三號(hào)篩，但粉末不宜過(guò)細(xì)，粉末過(guò)細(xì)，可能導(dǎo)致油室或油細(xì)胞破碎過(guò)多，在粉碎過(guò)程中造成揮發(fā)油散失過(guò)多，而且過(guò)細(xì)的粉末加水或加熱時(shí)成糊狀，容易引起焦化和沸騰現(xiàn)象。

（3）揮發(fā)油測(cè)定法加熱方式以可控溫電熱套最佳，因?yàn)殡姛崽椎陌l(fā)熱量比油浴大數(shù)倍，效果也非常好。同時(shí)也要注意清潔儀器，尤其是接收器的刻度部分，用乙醇溶液清潔干凈，避免油層粘附內(nèi)壁，不能完全下降到刻度管底部，影響讀數(shù)。

（4）運(yùn)用膠體磨法代替研磨法制備β－CD包合物，簡(jiǎn)單易行，水電資源消耗小，收率及揮發(fā)油的利用率均較高，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。

[1]李光武，蔣鴻雁，許東航，等.肉桂揮發(fā)油β-CD包合物制備工藝優(yōu)選[J].中國(guó)藥房，2007,18（21）：1623.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2005年版一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄57.

[3]劉力.正交試驗(yàn)優(yōu)選荊芥揮發(fā)油β-CD包合工藝研究[J].中國(guó)中藥雜志，2000，25（6）：348-349.