李研，陳省平，賴小敏，王聰，王娟，袁廣卿，彭毅

生物安全三級實驗室是按照我國《病原微生物實驗室生物安全管理條例》[1]和《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）[2]等有關(guān)病原微生物實驗室生物安全法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，以及 WHO《實驗室生物安全手冊》（第三版）[3]中的三級生物安全（biosafty level 3，BSL-3）防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)建立的病原微生物實驗室，是專門針對通過氣溶膠或其他途徑傳播，可導(dǎo)致嚴(yán)重后果或生命危險的內(nèi)源性和外源性病原而特設(shè)的適用于臨床、診斷、教學(xué)、科研的設(shè)施。高級別生物安全實驗室中所研究的病原體大多數(shù)具有氣溶膠感染的特性[4]。隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和近年來傳染性非典型肺炎（又稱嚴(yán)重急性呼吸綜合癥，severe acute respiratory syndromes，SARS）和高致病性禽流感等疾病的暴發(fā)流行，實驗室生物安全問題受到了社會各界的廣泛關(guān)注[5]。如何避免實驗室生物安全問題的產(chǎn)生已成為科研人員高度關(guān)注的問題。實驗室的消毒、滅菌是關(guān)鍵之一。目前，生物安全實驗室多采用物理及化學(xué)的方式來殺滅實驗室內(nèi)微生物或其他有害病原體。物理的消毒方法主要有紫外線照射、干熱滅菌、壓力蒸汽滅菌、高效空氣過濾器（high efficiency particulate air filter，HEPA 過濾器）過濾等。其中紫外線消毒是大多數(shù)普通生物實驗室采用的消毒方法，但紫外線消毒受很多因素影響，如管理意識、輻射強(qiáng)度、燈管的使用與保養(yǎng)等[6]?；瘜W(xué)消毒是使用消毒劑來殺滅病原微生物。在化學(xué)消毒劑中，甲醛熏蒸因為具有廣譜殺菌、使用方便和價格低廉等優(yōu)點，已成為國內(nèi)最為普遍的消毒、滅菌方法[7]。尤其在從事結(jié)核分枝桿菌研究的生物安全實驗室中有氣溶膠傳播的特性，采用甲醛熏蒸能針對懸浮在空氣中的小顆粒氣溶膠進(jìn)行消毒、滅菌。甲醛消毒原理是使病原體蛋白質(zhì)凝固、還原氨基酸、使蛋白質(zhì)分子烷基化等[8]。我們按照上述國內(nèi)外法規(guī)、指南和標(biāo)準(zhǔn)，以及本實驗室《生物安全三級實驗室消毒滅菌手冊》對實驗室進(jìn)行消毒，用平板培養(yǎng)法和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測法進(jìn)行消毒效果檢測和驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 自制普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于直徑 9 cm平皿中，經(jīng) 37 ℃ 24 h 培養(yǎng)驗證無菌后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 甲醛購自廣州化學(xué)試劑廠，純度為 37%，用單蒸水配制成 36% 甲醛溶液；DNA 抽提試劑盒購自美國Omega bio-tek公司；Taq DNA 聚合酶、Mg2+購自美國Promega 公司；核酸分子量 marker 購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 F-50 型甲醛熏蒸器購自北京克力愛爾生物有限公司；FORMA3111 型二氧化碳水套式培養(yǎng)箱購自美國 Forma 公司；VERITI96-WELL 型 PCR 儀購自美國 ABI 公司；G:BOXEF 凝膠成像系統(tǒng)購自英國 Syngene公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗室消毒 按房間體積計算，以 15 ml/m3比例計算出 36% 甲醛溶液的用量，將定量的甲醛溶液和中和劑氨水分別加入甲醛發(fā)生器內(nèi)相應(yīng)的 A 和 B 槽。按照WHO《實驗室生物安全手冊》（第三版）要求，將實驗室室內(nèi)溫度調(diào)節(jié)高于 25 ℃，相對濕度在 70% 左右。確認(rèn)實驗室內(nèi)無工作人員后，關(guān)閉消毒區(qū)域與外界相通的門和傳遞窗，以及中央送風(fēng)系統(tǒng)，遙控啟動甲醛發(fā)生器進(jìn)行熏蒸。房間熏蒸 8 h 以上。熏蒸后不立即通風(fēng)，房間密閉 24 h 后，打開通風(fēng)系統(tǒng)置換新鮮空氣，直至聞不到刺鼻甲醛氣味。

1.2.2 消毒滅菌效果平板培養(yǎng)法檢測 實驗室消毒后，用5 個 9 cm 普通平板培養(yǎng)基對實驗室內(nèi)空氣沉降 15 min采樣。分別置于實驗室的 4 個角落以及中央位置，相當(dāng)于人的呼吸道高度[9]。將采樣后的平板置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h 后，計數(shù)菌落數(shù)量。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌 PCR 特異性檢測 對實驗室內(nèi)易污染部位進(jìn)行甲醛熏蒸消毒前后采樣對比，包括：實驗室門把手、實驗臺面、生物安全柜門把手、顯微鏡調(diào)節(jié)旋鈕、二氧化碳培養(yǎng)箱門把手、冰箱門把手、傳遞窗按鈕以及高壓滅菌器開關(guān)及把手等。用浸有無菌生理鹽水的棉簽往返5 次擦拭各采樣點后，將棉簽浸入采樣管中。所有采樣標(biāo)本用 DNA 試劑盒抽提 DNA 后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 引物序列為：上游引物 5' CAGTGGAATTTCGCGGGTATC 3'，下游引物 5' CGTTGTTCAGCTCGGTAGCC 3'，可特異性擴(kuò)增 200 bp 左右的結(jié)核分枝桿菌早期分泌蛋白 6（ESAT-6）基因片段。PCR 反應(yīng)體系包含 cDNA 1 μl，dNTP mix（10 mmol/L）0.5 μl，上下游引物各 1 μl（10 μmol/L)，Taq DNA 聚合酶 0.125 μl（5 U/μl），Mg2+（25 mmol）3 μl 和5 × PCR buffer 5 μl，加重蒸水至 25 μl。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，循環(huán) 35 次；最后 72 ℃ 7 min 終止反應(yīng)。實驗設(shè)置陽性和陰性對照。以 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR 產(chǎn)物，凝膠成像儀下觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 普通平板培養(yǎng)菌落計數(shù)

平板培養(yǎng)后計數(shù)結(jié)果顯示，實驗室 4 個角落及中央位置菌落數(shù)分別為 0、2、1、0、0。符合生物安全三級實驗室的消毒滅菌要求。

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因片段結(jié)果

圖 1 為消毒前 PCR 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因片段結(jié)果。陽性對照（2 號加樣孔）和生物安全柜操作臺面（4 號加樣孔）有約為 200 bp 左右的陽性擴(kuò)增片段，其余各取樣擴(kuò)增管（3、5 ～ 10 號加樣孔）及陰性對照（1 號加樣孔）未見陽性擴(kuò)增片段，說明熏蒸前實驗操作臺面有污染。

圖 2 為熏蒸后 PCR 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因片段結(jié)果。陽性對照（2 號加樣孔）可見 200 bp 左右的擴(kuò)增片段，但各取樣擴(kuò)增管（3 ～ 10 號加樣孔）及陰性對照（1 號加樣孔）未見擴(kuò)增片段，說明熏蒸消毒、滅菌后各取樣點未檢測到結(jié)核分枝桿菌核酸序列，提示實驗室已無細(xì)菌污染，達(dá)到消毒滅菌效果。

3 討論

圖 1 熏蒸前 PCR 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因片段結(jié)果

圖 2 熏蒸后 PCR 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因片段結(jié)果

目前生物安全三級實驗室通過送排風(fēng)系統(tǒng)并經(jīng)過初、中、高效過濾器過濾，保證了實驗室內(nèi)空氣潔凈度為萬級到十萬級；同時輔助工作區(qū)與緩沖間之間，以及緩沖間與核心實驗室之間形成國家標(biāo)準(zhǔn)要求的負(fù)壓（遞增）梯度現(xiàn)狀，能夠為實驗室內(nèi)工作人員提供有效的生物防護(hù)。但在開展實驗活動時難免會有操作臺面等的污染。因此，我們進(jìn)行了甲醛熏蒸消毒滅菌效果驗證的系統(tǒng)研究。通過瓊脂平板培養(yǎng)實驗和 PCR 檢測驗證了甲醛熏蒸消毒的有效性。前者根據(jù)消毒滅菌操作后實驗室空間普通細(xì)菌殘留的數(shù)量間接檢測消毒滅菌的效果，但由于受實驗室本身潔凈度等因素的影響，這種方法只能作為消毒滅菌效果驗證的初步和補(bǔ)充方法；而后者由于能特異性檢測所操作的病原體核酸，具有方法簡便、快速、特異、敏感等特點[10]，可作為實驗室空間及儀器設(shè)備污染與否和消毒滅菌效果驗證最為準(zhǔn)確的方法，實際操作時可選擇在每次、周、月實驗結(jié)束清場（消毒滅菌）后定期和不定期，以及一個實驗周期結(jié)束后終末消毒滅菌效果驗證時進(jìn)行。應(yīng)注意取樣點的代表性和完整性，同時定期和不定期配合使用特定病原體的培養(yǎng)方法作補(bǔ)充。甲醛是一種高效的消毒劑，可通過熏蒸發(fā)生，使用起來簡單、方便、有效，對消毒物品無損害。但由于甲醛消毒效果受消毒環(huán)境的溫度、濕度、工作濃度以及熏蒸時間等因素的影響[4]，因此，在消毒時要嚴(yán)格控制條件以達(dá)到良好的消毒、滅菌效果。此外，因甲醛消毒后會有殘留，要注意人工擦拭去除表面的微量殘留[8]。實際使用時還要注意根據(jù)所消毒物品的性質(zhì)和空間大?。ㄈ鐚嶒炇曳块g、生物安全柜等）的不同，選擇適合的，不同規(guī)格、型號、能產(chǎn)生足量蒸汽的甲醛發(fā)生器。

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