栗一帆，梁志偉，姜惠敏

（1.山西省腫瘤醫(yī)院 普外二科，山西 太原 030013；2.洪洞縣人民醫(yī)院，山西 洪洞 031600；3.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030000）

血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）位于整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)的內(nèi)表面，具有抗凝、調(diào)控血管通透性、維持血管壁完整性、改變脂質(zhì)代謝和免疫調(diào)節(jié)等多項(xiàng)生理功能［1］。研究表明，移植心臟的慢性排斥反應(yīng)表現(xiàn)為迅速進(jìn)展的動(dòng)脈粥樣硬化而導(dǎo)致移植物的喪失［2］。通過(guò)體外培養(yǎng)建立穩(wěn)定的血管內(nèi)皮細(xì)胞系，對(duì)于研究移植心臟免疫排斥反應(yīng)具有重要意義。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL小鼠（山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心）。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（GIBCO公司），新生牛血清（杭州四季青公司），兔抗鼠抗Ⅷ相關(guān)抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），羊抗兔IgG工作液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器

CO2水套培養(yǎng)箱（美國(guó)Reveco公司），倒置相差顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠XS2－D2），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS，BX51）。

2 方法

2.1 取材

將小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉，75%酒精浸泡全身消毒5min。在超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌狀態(tài)下剪開胸腔，取出腹主動(dòng)脈至髂總動(dòng)脈分叉處。用眼科剪、鑷將血管剪碎，PBS液反復(fù)沖洗后置于DMEM培養(yǎng)液中備用。

2.2 原代培養(yǎng)

吸取組織塊接種到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶倒置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，使組織貼壁20min后，沿培養(yǎng)瓶側(cè)壁輕輕加入少許DMEM培養(yǎng)液，以剛沒(méi)過(guò)植塊為宜，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察植塊貼壁和血細(xì)胞遷出情況。組織塊植入后最先游出的是成纖維細(xì)胞，其次是平滑肌細(xì)胞，將織塊周圍遷出大量血細(xì)胞的組織塊可吸出接種到另一新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)再次重復(fù)貼壁20min的步驟，組織塊植入后48h無(wú)論血管內(nèi)皮細(xì)胞遷出與否，將組織塊去掉，并更換培養(yǎng)液，防止成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞遷出，以使培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)的主要為血管內(nèi)皮細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞傳代的方法

吸去或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。PBS液清洗兩次。向瓶?jī)?nèi)加入適量的消化液，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，加含血清的培養(yǎng)液迅速終止消化。棄去瓶?jī)?nèi)液體，加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過(guò)程要順序進(jìn)行，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到。計(jì)數(shù)，分別接種到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)中，一般3～7d換液1次，主要根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)液的顏色變化確定。當(dāng)細(xì)胞增殖旺盛，培養(yǎng)液由桃紅色變成黃色時(shí)，需換液1次，吸棄舊培養(yǎng)液，加PBS液2mL清洗后吸棄，再加入新鮮培養(yǎng)液2～3mL，也可進(jìn)行半量或2／3量換液。

2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

使用計(jì)數(shù)板，上面蓋上蓋玻片，滴一滴細(xì)胞液，在顯微鏡下觀察，在左上、左下、右上、右下各有四個(gè)小格，每個(gè)小格內(nèi)有16個(gè)小格，分別計(jì)數(shù)，四個(gè)小格相加，除以4，后面加上（×104），再乘以稀釋的倍數(shù)，就是估計(jì)的細(xì)胞數(shù)。

2.5 細(xì)胞鑒定（免疫組織化學(xué)染色）

將第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液接種到預(yù)先放置有蓋玻片的六孔板中。待細(xì)胞基本長(zhǎng)成單層后，取出蓋玻片，PBS洗5min×3次。4%多聚甲醛室溫下固定15min，PBS再次洗5min×3次。將已固定好的細(xì)胞玻片放入蓋片染色缸。PBS振洗5min，取出吹干。滴加兔抗鼠Ⅷ因子抗體，置入濕盒內(nèi)。37℃保溫30min或4℃冰箱過(guò)夜。PBS洗5min×3次。滴加辣根過(guò)氧化物酶聚合物標(biāo)記羊抗兔IgG工作液，37℃孵育30min。PBS洗5min×3次。蒸餾水沖洗1次，50%緩沖甘油封片，鏡檢。

3 結(jié)果

3.1 倒置顯微鏡觀察

細(xì)胞培養(yǎng)48h后，可見(jiàn)大部分貼壁細(xì)胞連接形成網(wǎng)狀，細(xì)胞密度較低。3～5d后，內(nèi)皮細(xì)胞島出現(xiàn)。繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞島增大，可分為密度較大的中央?yún)^(qū)和密度較小的邊緣區(qū)。約7～9d后細(xì)胞融合成片。VEC呈單層鑲嵌狀排列，呈現(xiàn)“鵝卵石樣”或“鋪路石樣”，出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。

圖1 倒置顯微鏡下觀察第一代血管內(nèi)皮細(xì)胞 100×

圖2 倒置顯微鏡下觀察第二代血管內(nèi)皮細(xì)胞 100×

圖3 倒置顯微鏡下觀察第三代血管內(nèi)皮細(xì)胞 100×

3.2 生長(zhǎng)曲線的繪制

圖4 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3.3 免疫組化結(jié)果

圖5 免疫組化染色 200×

4 討論

小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)的條件較為苛刻，在培養(yǎng)過(guò)程中可能存在以下問(wèn)題：

（1）內(nèi)皮細(xì)胞的純化。血管內(nèi)層為內(nèi)皮細(xì)胞，中層為平滑肌細(xì)胞，外層為成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞體外共同培養(yǎng)時(shí)具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，如果不在培養(yǎng)早期去除這些污染細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞將不能增殖、傳代。Zhao等［3］采用熒光激活細(xì)胞分類器（fluorescence－activated cell sorter，F(xiàn)ACS）分離人腦血管細(xì)胞，效果良好。Favaro等采用免疫磁珠（immunomagnetic beads）進(jìn)行人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離，效果良好。上述兩種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)器材要求較高且費(fèi)用昂貴。Cheng等研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞首先從組織塊中游離出來(lái)，成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞則會(huì)在培養(yǎng)72h后游離。原代培養(yǎng)60h后去除漂浮的細(xì)胞及組織植塊，可保證剩余細(xì)胞大部分為內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞。傳代培養(yǎng)1～2次后血細(xì)胞可以清除。

（2）培養(yǎng)液的選擇。一般原代培養(yǎng)需要較高濃度的血清，而傳代培養(yǎng)時(shí)血清濃度可以降低。研究顯示，20%的胎牛血清對(duì)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)有利，傳代后的內(nèi)皮細(xì)胞可以在含10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。

（3）內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定。血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定常用的方法：免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)免疫標(biāo)志物；倒置顯微鏡觀察的

細(xì)胞形態(tài)特征和生長(zhǎng)方式；RT－PCR（reverse trascriptase polymerase chain reaction）、流式細(xì)胞儀、蛋白組學(xué)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的特異性蛋白質(zhì)。

［1］ CARVALHO D，SAVAGE CO，ISENBERG D，et al.IgG anti－endothelial cell autoantibodies from patients with systemic lupus erythematosus or systemic vasculitis stimulate the release of two endothelial cell－derived mediators，which enhance adhesion molecule expression and leukocyte adhesion in an autocrine manner［J］.Arthritis Rheum，1999，42（4）：631－640.

［2］ CORTESINI R，SUCIU－FOCA N.ILT3＋I(xiàn)LT4＋tolerogenic endothelial cells in transplantation［J］.Transplantation，2006，82（1Suppl）：S30－32.

［3］ ZHAO Y，TAN YZ，ZHOU LF，et al.Morphological observation and in vitro angiogenes is assay of endothelial cells isolated from human cerebral cavernous malformations［J］.Stroke，2007，38（4）：1313－1319.