江書慶，信建豪，竇運(yùn)修

（黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450063）

鉛是一種嚴(yán)重危害人類健康的重金屬元素，是出現(xiàn)在人類文明社會(huì)中最嚴(yán)重的環(huán)境污染物之一，它可以影響人類的各類器官，如神經(jīng)、造血、消化、泌尿、生殖、心血管、內(nèi)分泌、免疫、骨骼等［1］。鉛中毒問題既是一個(gè)古老的問題，又是一個(gè)探索不盡的新問題。進(jìn)入體內(nèi)的物質(zhì)要通過血漿貯存與運(yùn)輸才能達(dá)到受體部位產(chǎn)生作用，而血清白蛋白可與許多內(nèi)源和外源性物質(zhì)結(jié)合以形成血清白蛋白的傳輸功能［2］。

牛血清白蛋白（BSA）是一種球蛋白，具有緊湊的橢圓結(jié)構(gòu)，其原始結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要來自疏水作用。它對(duì)大多數(shù)小型離子和分子具有很高的親合力，為了表征小離子或分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用，通常研究小離子或分子與牛血清白蛋白的結(jié)合。研究小離子或小分子與牛血清白蛋白的結(jié)合的常用實(shí)驗(yàn)方法有直接分光光度法［3］、凝膠過濾方法［4］、熒光光度法［5］和平衡透析法［6］等。直接分光光度法和熒光光度法測(cè)定時(shí)誤差較大，而凝膠過濾法和平衡透析法測(cè)定的準(zhǔn)確度雖然較高，但是操作起來耗時(shí)太長(zhǎng)。直接電位法不受溶液的顏色、濁度等影響［7］，具有高選擇性、高準(zhǔn)確度、快速、方便等優(yōu)點(diǎn)，用以研究小離子與BSA結(jié)合，具廣闊的應(yīng)用前景，但現(xiàn)階段國內(nèi)外研究較少［8］。

1946年Klotz等人在研究有機(jī)陽離子如甲基橙、氮磺胺噻唑與BSA相互作用時(shí)，推導(dǎo)出Klotz方程［6］，方程形式如下：

其中，r為被BSA結(jié)合的離子的摩爾數(shù)與BSA的總摩爾數(shù)的比值，［L］為自由離子的平衡濃度，K為內(nèi)在分解常數(shù)，n為最大結(jié)合數(shù)。該方程用于直接電位法測(cè)定鉛離子與BSA的最大結(jié)合數(shù)和結(jié)合平衡常數(shù)，獲得較好的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

pHS－3CT型精密酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）；PXSJ－216型離子活度計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）；鉛離子選擇性電極（上海電光器件廠）；217型雙接界甘汞電極（內(nèi)充0.1mol／L的KNO3溶液）；恒速磁力攪拌器（深圳天南海北有限公司）。牛血清白蛋白（BSA）（上海博世化學(xué)品有限公司，相對(duì)分子量：66，000）；pH5.0的醋酸緩沖溶液；Pb2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液：用Pb（NO3）2固體先配制成0.1mol／L的溶液，將該溶液逐級(jí)稀釋，并在稀釋過程中加入緩沖溶液和NaCl作為離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑，使pH和離子強(qiáng)度恒定。得到一系列Pb2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。其它試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 電極電位的測(cè)量方法

鉛離子選擇性電極使用之前先在1.0×10－3mol／L的Pb（NO3）2溶液中浸泡活化48h，用水沖洗后與217型甘汞電極組成測(cè)量電池，連接離子活度計(jì)，測(cè)量水的空白電位值，待其穩(wěn)定后即可測(cè)量試液。

1.2.2 Pb2＋與BSA相互作用分析

準(zhǔn)確稱取0.0660gBSA于7個(gè)10mL容量瓶中，分別加入1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL的10－2mol／L Pb（NO3）2標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別加入計(jì)算量的緩沖溶液和NaCl作為離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑，使其pH值和離子強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同，并定容后搖勻。將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到25mL的燒杯中，在攪拌器上恒速攪拌10min后，用鉛離子選擇性電極和參比電極組成的測(cè)量電池測(cè)量其電位。

2 結(jié)果

2.1 電極Nernst響應(yīng)曲線

利用方法“1.2.1”依次測(cè)量該電極在1.0×10－7～1.0×10－2（mol／L）的Pb（NO3）2溶液中的電位值E，以電位E對(duì)Pb（NO3）2濃度（moL／L）的負(fù)對(duì)數(shù)pC作圖，見圖1。實(shí)驗(yàn)表明在Pb（NO3）2濃度為1.0×10－2～2.0×10－6moL／L范圍內(nèi)，E～pC具有良好的線性關(guān)系。在該濃度范圍內(nèi)用線性回歸計(jì)算出該曲線的線性方程為：E＝－61.13＋28.58pC，Nernst響應(yīng)斜率為28.58mV／pC，相關(guān)系數(shù)為0.9993。

2.2 結(jié)合位數(shù)與平衡常數(shù)的計(jì)算

圖1 鉛離子選擇性電極的Nernst響應(yīng)曲線

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確和穩(wěn)定，測(cè)試液的pH和離子強(qiáng)度經(jīng)過精確調(diào)節(jié)，并用磁力攪拌器恒速攪拌，此時(shí)鉛離子選擇性電極所檢測(cè)信號(hào)的重現(xiàn)性良好，平均相對(duì)偏差不大于1.3%（n＝4）。

圖2 鉛離子與BSA相互作用

鉛離子與BSA的結(jié)合速度較快，使用鉛離子選擇性電極監(jiān)測(cè)鉛離子與BSA結(jié)合過程，實(shí)驗(yàn)表明10min后電位達(dá)到了恒定，證明10min后鉛離子與BSA結(jié)合達(dá)到了平衡。所以實(shí)驗(yàn)選擇10min作為相互作用時(shí)間。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

利用鉛離子選擇性電極測(cè)定溶液中其他組分的選擇性系數(shù)用以證明這些組分是否會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾，實(shí)驗(yàn)表明，溶液中存在的各組分的選擇性系數(shù)均小于10－4。證明該體系無明顯干擾。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)［9］進(jìn)行比較，其結(jié)果出入較大。原因可能在于熒光分析中，雖然以靜態(tài)猝滅為主，但動(dòng)態(tài)猝滅可能同時(shí)存在，造成結(jié)果誤差。直接電位法檢測(cè)的是自由鉛離子的濃度，其他組分干擾較小，結(jié)果可能更加準(zhǔn)確。

［1］王蟹，徐輝碧，屠任覆，等.生命科學(xué)中的微量元素（下卷）［M］.北京：中國計(jì)量出版社，1992：566－5881.

［2］ULRICH KH.Molecular aspects of ligand binding to serum albumin［J］.Pharmacol Rev，1981，33（1）：17－53.

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［5］YAN WANG，YAN CHENG，HONG FANG SUN.Interaction of nicotine and bovine serum albumin［J］.Chinese Chemical Letters，2000，11（3）：247－250

［6］KLOTZ I M，WALKER，F(xiàn) M，PIVAN R B.The binding of organic ions by proteins［J］.Journal of American Chemical Society，1996，68（15）：486－1490.

［7］汪世花，馬軍霞.離子選擇電極示蹤技術(shù)及其應(yīng)用與展望［J］.勘察科學(xué)技術(shù)，2001，12（5）.

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［9］吳根華，汪春華.熒光法研究Pb2＋與牛血清白蛋白的相互作用［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2005，18（2）.