劉艷華 翟 斐 王心靜 曹志紅 楊秉芬 程小星 (解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究室，北京100091)

結(jié)核病是目前世界上死亡率最高的慢性傳染病。近年來多耐藥性結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)以及與HIV共感染病例的增加，使得結(jié)核病人的死亡率不斷上升，臨床特效藥的匱乏和BCG疫苗接種效果的差強人意，使得結(jié)核病的防治面臨嚴峻挑戰(zhàn)［1］。活動性結(jié)核病人常表現(xiàn)為免疫抑制，深入開展結(jié)核病的免疫病理學研究對結(jié)核病的防治具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子PLZF(Promyelocytic leukemia zinc finger)是轉(zhuǎn)錄抑制因子BTB/POZ的家族成員。研究表明，PLZF在 γδT細胞、NK細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞中廣泛表達，是iNKT細胞(Invariant CD1d-dependent natural killer-like T cells)發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和發(fā)揮效應功能必須的調(diào)節(jié)因子［2-4］。iNKT細胞是上世紀90年代后期在人類中發(fā)現(xiàn)的一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的T細胞亞群。成熟的iNKT細胞經(jīng)過抗原刺激活化后能迅速分泌IFN-γ、IL-4、IL-10等細胞因子，調(diào)節(jié)機體的先天性免疫和獲得性免疫［5，6］。研究表明，iNKT細胞在抗 MTB 感染免疫中發(fā)揮重要作用，但是活動性結(jié)核病人外周血中iNKT細胞的數(shù)量通常減少［7，8］，具體機制還不清楚。

本研究通過熒光定量RT-PCR方法比較了活動性結(jié)核病人和健康人PBMCs中PLZF mRNA的表達差異，流式細胞術(shù)分析了兩組樣本的iNKT細胞含量，結(jié)果顯示活動性結(jié)核病人PBMCs中PLZF mRNA的表達和iNKT細胞含量均顯著低于健康對照，PLZF mRNA的表達水平與iNKT細胞的百分含量成正相關(guān)，提示活動性結(jié)核病人PBMCs中PLZF表達降低與iNKT細胞的減少相關(guān)，可能與活動性結(jié)核病人的免疫抑制相關(guān)。

1 材料與方法

1.1受試者的篩選 活動性結(jié)核病人為309醫(yī)院結(jié)核病研究所診斷明確的住院病人。結(jié)核病的診斷依據(jù)包括：痰涂片抗酸染色、分枝桿菌細菌培養(yǎng)、胸部X射線檢查、以及臨床癥狀和抗結(jié)核治療的效果。本研究選擇的活動性結(jié)核病人沒有其他基礎疾病，病程不超過2個月，入院治療不超過2周。對照組為309醫(yī)院體檢中心常規(guī)健康體檢項目正常(包括胸部X射線表現(xiàn)正常)的健康人。本研究經(jīng)309醫(yī)院倫理道德委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2臨床標本的采集 篩選21例診斷明確的活動性結(jié)核病人，平均年齡為39歲，采集其靜脈血2 ml。22例體檢中心健康人，平均年齡為37歲，采集靜脈血2 ml。抗凝血于室溫放置，在采集后6小時內(nèi)處理。

1.3PBMCs的分離 Ficoll淋巴細胞分離液(GE公司)分離抗凝血。具體方法為：取2 ml平衡至室溫的Ficoll到離心管中，再緩慢加入2 ml混勻的抗凝血，2 000 r/min離心20分鐘，吸取中間的白膜層，加入到裝有10 ml 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)的離心管中洗滌，1 000 r/min離心10分鐘，去上清，沉淀即為PBMCs。

1.4細胞總RNA的提取 Trizol(Invitrogen公司)法提取細胞總RNA。具體操作為：按1×106細胞/1 ml Trizol的比例加入Trizol，渦旋使其完全裂解，室溫靜置5分鐘;按0.2 ml氯仿/1 ml Trizol加入氯仿，渦旋30秒后室溫靜置5分鐘，4℃ 11 400 r/min離心15分鐘，取上層無色水相至新離心管中;按0.5 ml異丙醇/1 ml Trizol的比例加入異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘，沉淀RNA，4℃ 11 400 r/min離心10分鐘，棄上清;加入1 ml 75%的乙醇洗滌沉淀，4℃ 8 700 r/min離心10分鐘，棄上清，室溫干燥10分鐘;加入 100 μl DEPC處理的無 RNAase的ddH2O，-20℃保存。

1.5cDNA合成 采用Applied Biosystems公司逆轉(zhuǎn)錄試劑，按說明書操作。反應體系為：總RNA為5 μl，dNTPs(100 mmol/L) 為 0.2 μl，MultiScribe 逆轉(zhuǎn)錄酶為 1 μl，10 × RT buffer為 2 μl，RNase inhibitor(20 U/μl)為 0.2 μl，Oligo(dT)為 2 μl，DEPC 水為 9.6 μl，共20 μl。反應條件為16℃ 30 分鐘，42℃30分鐘，85℃ 5分鐘。

1.6PLZF和HPRT基因擴增引物的序列與合成根據(jù)文獻［2］中的PLZF和HPRT引物，擴增片段分別為73 bp和78 bp。PLZF引物：上游5＇-TAGTTTGCGGCTGAGAATGC-3＇;下游 5＇-ACCGCACTGATCACAGACAAAG-3＇。HPRT 引物：上游 5＇-GAAAGGGTGTTTATTCCTCATGG-3＇; 下 游：5＇-CTCCCATCTCCTTCATCACATC-3＇。引物由北京賽百盛公司合成。

1.7熒光定量PCR 采用北京天根生物有限公司的SYBR Green1熒光定量試劑盒檢測樣本中PLZF和HPRT的表達。反應體系為：12.5 μl的Premix，上下游引物各 0.5 μl(工作濃度為 0.5 μmol/L)，cDNA 模板為 2.5 μl，DEPC 水為 9 μl。PCR 反應條件：50℃ 2分鐘，95℃ 2分鐘，然后95℃ 15秒，53℃30秒，進行45個循環(huán)。

1.8流式細胞儀檢測iNKT細胞的含量 用含2%胎牛血清(杭州四季青)的PBS緩沖液(Wash buffer)重懸分離的 PBMCs，取(2～3)×105個細胞，2 000 r/min離心5分鐘，棄上清，細胞沉淀用抗體稀釋液染色(含 25 μl Wash buffer，7 μl anti-Vα24-PE 和 7 μl anti-Vβ11-FITC 抗體，Beckman 公司)，4℃避光靜置30分鐘，然后用1 ml Wash buffer重懸，2 000 r/min離心 5分鐘，沉淀用 500 μl Wash buffer重懸，利用流式細胞儀(Beckman公司)檢測，細胞含量用Flow Jo軟件分析。

1.9數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析 采用2-(CtPLZF-CtHPRT)方法計算每個樣本中 PLZF的相對表達量，采用GraphPab Prism 5.0軟件的Mann-Whitney test分析活動性結(jié)核病人PBMCs中PLZF mRNA的表達和iNKT細胞含量是否有統(tǒng)計學差異，P＜0.05為差異顯著。采用Spearman相關(guān)性分析PLZF的表達量和iNKT細胞含量的相關(guān)性，P＜0.05為顯著性相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1細胞總RNA質(zhì)控 在RT-PCR實驗中，細胞總RNA的純度和完整性是進行下游實驗的基本要求。通過確保所有RNA樣品純度和質(zhì)量的一致性可以降低生物學重復的差異。本實驗提取的所有RNA樣品經(jīng)OD260/280分光光度法檢測比值均在1.8～2.0之間，表明RNA質(zhì)量良好，沒有蛋白質(zhì)和苯酚的污染。本實驗經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可觀察到28s RNA、18s RNA和5s RNA三條帶，其中28s RNA的條帶亮度大約是18s RNA條帶亮度的2倍，提示提取的RNA樣本完整性較好(見圖1)。

2.2基因擴增的退火溫度和特異性檢測 本實驗對PLZF和HPRT的擴增退火溫度進行了優(yōu)化，實驗的退火溫度范圍為50℃ ～65℃，結(jié)果顯示在退火溫度為53℃時，PLZF和HPRT的Ct值最小，表明在此溫度下擴增效率最高。隨后本實驗對PLZF和HPRT擴增特異性進行檢測，PCR反應的溶解曲線顯示PLZF和HPRT分別顯示單一峰，提示PCR產(chǎn)物為單一產(chǎn)物(見圖2)。

2.3PLZF和HPRT基因擴增效率的檢測 采用2-△△Ct方法對目的基因進行相對定量。條件是目標基因和參照基因擴增效率接近100%，且相互間效率偏差在5%以內(nèi)，因此，必須驗證目標基因和參照基因的擴增效率。一般用標準曲線來確定qPCR的反應效率。本實驗將反轉(zhuǎn)錄的cDNA進行4倍的梯度稀釋，對每個稀釋度做3次重復，取其平均Ct值，做濃度/Ct的標準曲線。結(jié)果顯示PLZF基因的擴增效率為91%，HPRT的擴增效率為92%，擴增效果較好，表明此反應體系可以用于PLZF相對表達量的計算(見圖3)。

圖1 細胞總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig．1 Agarose gel electrophoresis of cellular total RNA

圖2 PLZF和HPRT基因擴增的溶解曲線圖Fig．2 The dissolution curve of the PLZF gene and the HPRT gene in 53℃

2.4活動性結(jié)核病人和健康人PLZF的相對表達量比較及統(tǒng)計學分析 本實驗活動性結(jié)核病人組年齡在21～65歲，平均年齡為(39±12)歲，健康對照組年齡在22～52歲，平均年齡為(37±9)歲。公2-健康人(CtHPRT-CtPLZF)。結(jié)果顯示活動性結(jié)核病人 PBMCs中PLZF mRNA的表達比健康對照的表達低，是健康對照的0.67倍，結(jié)果有顯著差異，P=0.0102(見表1和圖4)。

圖3 PLZF和HPRT的標準曲線圖Fig．3 Standard curve of the PLZF and HPRT gene

圖4 活動性結(jié)核病人和健康人PLZF mRNA表達比較Fig．4 The comparison of PLZF mRNA in active TB and healthy controls

表1 活動性結(jié)核病人和健康人PBMCs中PLZF mRNA的相對表達Tab．1 The expression of PLZF mRNA in PBMCs of active TB and healthy controls

圖5 活動性結(jié)核病人和健康人iNKT細胞百分含量比較Fig．5 The comparison of iNKT percentage in active TB and healthy controlsNote：*.P＜0.05.

2.5活動性結(jié)核病人和健康人iNKT細胞含量比較及統(tǒng)計學分析 活動性結(jié)核病人外周血iNKT含量為0.03%(0.12%/0.00%)，健康人外周血iNKT含量為0.09%(0.21%/0.01%)，兩組數(shù)據(jù)差異顯著(P=0.001 2)，表明活動性結(jié)核病人外周血中iNKT細胞數(shù)量顯著下降(見圖5)，同本室之前發(fā)表的結(jié)果一致［8］。

2.6PLZF的表達和iNKT細胞含量的相關(guān)性分析為了研究PLZF mRNA的表達與iNKT細胞的含量是否相關(guān)，活動性結(jié)核病人的PBMCs分兩份，一份提取RNA，熒光定量PCR檢測PLZF mRNA的表達，一份用iNKT細胞的特異性抗體標記，流式細胞術(shù)檢測iNKT細胞的表達。然后通過統(tǒng)計學軟件分析PLZF mRNA的表達和iNKT細胞含量的相關(guān)性。Spearman相關(guān)性分析顯示，r=0.480 4、P=0.027 5見圖6，表明活動性結(jié)核病人PLZF mRNA和iNKT細胞的含量成顯著性正相關(guān)，提示PLZF mRNA表達降低與iNKT百分含量的減少有關(guān)。

3 討論

PLZF/ZBTB16最初被鑒定為急性前髓細胞性白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)染色體異位的視磺酸受體(Retinoic acid receptor α，RARα)的融合蛋白。PLZF是POK(POZ and Kruppel)蛋白家族中的一個轉(zhuǎn)錄抑制子，包括一個N末端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和C末端的9個C2H2Kruppel樣鋅指結(jié)構(gòu)域，BTB/POZ結(jié)構(gòu)域能介導同源或異源蛋白質(zhì)的二聚，Kruppel樣鋅指結(jié)構(gòu)通過與啟動子調(diào)節(jié)區(qū)相應反應元件的相互作用抑制啟動子轉(zhuǎn)錄，PLZF的鉸鏈區(qū)含一個PEST結(jié)構(gòu)域，能啟動泛素化降解PLZF［2］。

圖6 活動性結(jié)核病人PLZF mRNA表達與iNKT細胞含量的相關(guān)性分析Fig．6 The correlation of PLZF expression and iNKT percentage in active TB

研究表明，PLZF是iNKT細胞發(fā)育和發(fā)揮功能所必須的轉(zhuǎn)錄因子。PLZF缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠中CD1d限制性NKT細胞發(fā)育受損，在外周組織中的數(shù)量嚴重降低，發(fā)育的iNKT缺乏天然樣T細胞的許多特性，如聚集在淋巴結(jié)中而不是肝臟中，不表達NKT表面標志，沒有活化表型，活化后也不能分泌大量的IL-4和IFN-γ［2-4］。此外，PLZF是高表達CD44記憶表型T細胞CD44hi MP T(包括NKT、MAIT和CD8αα等固有樣T細胞)細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)子。這些研究提示PLZF 與宿主的免疫反應密切相關(guān)［9，10］。

iNKT細胞在抗MTB感染免疫中發(fā)揮重要作用。MTB感染小鼠經(jīng)iNKT活化配體αGalCer治療后生存時間顯著延長。研究表明，數(shù)量有限的iNKT細胞在體外能充分抑制MTB的復制，并且將未感染MTB小鼠的原發(fā)性脾iNKT細胞轉(zhuǎn)移至感染致病性MTB小鼠體內(nèi)后，能顯著降低后者肺臟中MTB的載量。此外，MTB感染的小鼠經(jīng)anti-CD1單抗處理后，體內(nèi)MTB復制能力增強并且脾細胞產(chǎn)生的IFN-γ和TNF-α減少［11］。研究證實，活動性結(jié)核病人 PBMCs中iNKT 細胞數(shù)量減少［7，8］，但其機制還不清楚。

本研究通過對活動性結(jié)核病人和正常人PBMCs中PLZF的定量分析，顯示PLZF在活動性結(jié)核病人是表達降低的，通過對活動性結(jié)核病人PBMCs中PLZF mRNA的表達和iNKT細胞的含量的相關(guān)性分析，顯示PLZF mRNA的表達與iNKT細胞含量成正相關(guān)，提示活動性結(jié)核病人PBMCs中PLZF的表達降低與iNKT細胞的減少相關(guān)。進一步研究PLZF表達降低對iNKT細胞功能的影響以及PLZF表達降低與免疫抑制的關(guān)系對結(jié)核病的免疫抑制研究和免疫防治有重要意義。

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