王海灝 仰霈雯 雷家慧 (華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院器官移植研究所教育部器官移植重點實驗室衛(wèi)生部器官移植重點實驗室，武漢430030)

越來越多的研究表明，在人體內(nèi)存在著一群具有免疫抑制功能的細胞，這些細胞在誘導移植免疫耐受、控制自身免疫性疾病和腫瘤免疫等方面發(fā)揮著重要的作用。因為這種特殊的細胞可以對免疫反應進行調(diào)節(jié)，所以顧名思義被稱為調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)［1-3］。目前已知，人 Treg 被區(qū)分為兩大類：即自然性調(diào)節(jié)性T細胞(natural Treg，nTreg)和誘導性調(diào)節(jié)性T細胞(induced Treg，iTreg)。有研究表明，nTreg在胸腺中產(chǎn)生，而iTreg則是在外周血或外周淋巴組織中，由原始T細胞(na ve T cells)受到自體或異體的抗原刺激而產(chǎn)生［4］。雖然，人nTreg和iTreg都具有免疫抑制功能，但iTreg在誘導移植物免疫耐受中的作用更重要。

1995 年，Sakaguchi等［5］率先報道了 CD4+CD25+T細胞具有免疫抑制功能;然而，隨著研究的深入，人和鼠的體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)活化的T細胞也表達CD25;進一步的研究發(fā)現(xiàn)，只有高表達 CD25(CD25high)的CD4+T細胞才能在體外發(fā)揮免疫抑制功能［6-8］。2003年，Sakaguchi研究組發(fā)現(xiàn)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead transcription factor，F(xiàn)oxP3)與Treg的發(fā)育及功能密切相關［9］。動物實驗的結(jié)果顯示FoxP3僅表達于Treg，而不表達于未激活的CD4+CD25-T 細胞或 Th1、Th2 等細胞中［9，10］，因此，直到現(xiàn)在CD4+CD25+FoxP3+都被公認為最具代表性的Treg的細胞表型。近年來，另一個人Treg的細胞標志物CD127-逐漸被人們所熟悉，IL-7受體CD127表達在細胞表面，并且與FoxP3呈明顯的負相關，Treg 不表達或弱表達 CD127［11］。

雖然iTreg的作用有細胞與細胞間接觸和分泌細胞因子兩種途徑，但是無論在體外還是體內(nèi)實驗的結(jié)果都表明，分泌細胞因子的途徑是起主要作用的［12，13］。因此，除了上述的這些特異性細胞標志物外，一些非特異性的細胞因子也因為與iTreg的功能相關而被用于 iTreg的細胞表型中，如 IL-2-、IL-10+、TGF-β+、IFN-γ+等。

然而，在靜態(tài)條件下，T細胞并不或僅少量分泌產(chǎn)生細胞因子，為了研究細胞因子的變化，必須首先激活淋巴細胞。目前常用的淋巴細胞刺激劑為PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate，豆蔻酰佛波醇乙酯)和Ionomycin(離子霉素)，二者聯(lián)合使用被視為淋巴細胞最經(jīng)典的多克隆刺激劑。然而，PMA/Ionomycin的刺激有一個無法回避的缺陷，即會顯著抑制CD4的表達，這一特點對實驗對象為CD4+T細胞的相關研究(如研究iTreg)將產(chǎn)生不利影響。近年來，其他的淋巴細胞刺激劑也陸續(xù)出現(xiàn)在相關報道中，如PHA(Phytohaemagglutinin，植物血凝素)等。本研究分別使用PMA/Ionomycin和PHA對人淋巴細胞進行刺激，檢測iTreg的誘導和細胞表型變化，分析其多樣性。本實驗在體外分離人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)后進行多克隆刺激，誘導產(chǎn)生iTreg，以四色流式細胞儀檢測其表達特異性/非特異性細胞標志物和相關細胞表型的變化。

1 材料與方法

1.1健康受試者 本實驗中每組實驗均選取5名健康受試者。本實驗實施前已經(jīng)獲得本單位倫理委員會批準，并遵循《赫爾辛基宣言》的精神。所有健康受試者均被詳細告知本實驗的過程和目的，并簽署知情同意書。

1.2實驗分組 實驗依不同的實驗方法分為4組：①空白對照組：分離出PBMC后馬上染色檢測;②非刺激對照組：PBMC與細胞培養(yǎng)液RPMI1640(購自Invitrogen Gibco公司)培養(yǎng)16小時后檢測;③PMA/Ionomycin刺激組：將 PBMC與含 PMA/Ionomycin(購自Sigma公司)的培養(yǎng)液培養(yǎng)16小時后檢測;④PHA刺激組：將PBMC與含PHA(購自Remel公司)的培養(yǎng)液培養(yǎng)16小時后檢測。

1.3細胞制備、培養(yǎng) 用Ficoll梯度離心法從外周血(50 ml)中提取外周血單個核細胞(PBMC)。用含10%胎牛血清(FCS-500)的RPMI1640將試管中PBMC的濃度調(diào)整為1×106ml-1?？瞻讓φ战M的PBMC馬上染色并上機檢測，其余各組則以1∶1的比例，將PBMC與10%RPMI1640細胞培養(yǎng)液(非刺激對照組)、含 PMA(10 ng/ml)/Ionomycin(1 μg/ml)的培養(yǎng)液(PMA/Ionomycin刺激組)或含PHA(180 μg/ml)的培養(yǎng)液(PHA刺激組)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時。

1.4流式細胞計數(shù)檢測前準備 將培養(yǎng)后的PBMC從培養(yǎng)箱中取出，依分組移入準備好的試管，1 300 r/min離心8分鐘，棄上清。以10 μl PerCP-mouse-IgG1、20 μl FITC-mouse-IgG1、20 μl APC-mouse-IgG1以及 20 μl PE-rat-IgG1(均購自 BD公司)作為Isotype control;依實驗計劃，在試管中加入細胞表面抗體 CD4(PerCP，20 μl，BD)、CD25(APC，5 μl，BD)、CD127(FITC，5 μl，BD)，振蕩后室溫下避光培養(yǎng)15分鐘，加入2 ml緩沖液(DPBS，購自Invitrogen Gibco公司)，洗細胞(1 300 r/min轉(zhuǎn)速離心 8分鐘，棄上清)。加入 500 μl Perm2溶液(BD公司)作細胞透膜處理，振蕩后室溫下避光培養(yǎng)10分鐘。再加入2 ml DPBS洗細胞。加入胞內(nèi)抗體 FoxP3(PE，20 μl，BD)、FoxP3(FITC，5 μl，eBioscience)、IFN-γ (FITC，10 μl，BD)、IL-2(FITC，10 μl，BD)、IL-10(PE，10 μl，BD)、TGF-β(PE，20 μl，R＆D)。振蕩后室溫下避光培養(yǎng)30分鐘，加入2 ml DPBS洗細胞;再加入2 ml DPBS，繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，洗細胞。以四色流式細胞儀(Flow Cytometry，Calibur，BD公司)檢測。

1.5流式檢測的設門策略 每支試管有至少100 000信號被記錄和分析。首先根據(jù)前向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)設門選擇淋巴細胞群，然后再根據(jù)不同的實驗目的進行再次設門，如選擇CD4+CD25+PBL等。

1.6統(tǒng)計學分析 本實驗所有實驗數(shù)據(jù)用±s的形式表達，用 PASW Statisticc 18.0(IBM，Chicago，Illinois，USA)統(tǒng)計軟件進行方差分析，以P＜0.01為有明顯統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1PHA不抑制T細胞CD4的表達 圖1所示可見本實驗的設門策略。與非刺激組相比，PMA/Ionomycin刺激16小時后，CD4的表達明顯下降;同時，PHA刺激后，CD4的表達并不明顯減少。有意思的是，從圖1中還可以發(fā)現(xiàn)，PMA/Ionomycin和PHA的多克隆刺激后，CD3的表達均略有下降?？梢?，PMA/Ionomycin的刺激可以顯著抑制T細胞CD4分子的表達，而PHA并不抑制其表達。

2.2兩種多克隆刺激均可明顯誘導產(chǎn)生大量CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg 圖2所示，在從全血分離得到PBMC(空白對照組)中，CD4+CD25+FoxP3+CD127-占全部CD4+T細胞的比例僅為2.0% ±2.6%，即為nTreg的含量。在細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)16小時后，這一比例未見明顯變化(P=n.s.);用PMA/Ionomycin刺激 16小時后，CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg的表達升為26% ±19%(P＜0.01)，而用PHA刺激16小時后則上升為49% ±8.3%(P＜0.01)。實驗結(jié)果表明，細胞培養(yǎng)液并不能誘導產(chǎn)生CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg，而不論是PMA/Ionomycin還是PHA，均可以顯著誘導產(chǎn)生CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg。

圖1 設門策略及CD3和CD4分子在多克隆刺激下的表達Fig．1 Gating strategy and expressions of CD3 and CD4 during polyclonal stimulation

圖2 CD4+CD25+FoxP3+CD127－PBL在兩種多克隆刺激條件下的表達Fig．2 Expression of CD4+CD25+FoxP3+CD127－ PBL during polyclonal stimulation

2.3多克隆刺激對 IL-2-、IL-10+和 TGF-β+Treg的影響 多克隆刺激后CD4+CD25+FoxP3+IL-2-、CD4+CD25+FoxP3+IL-10+和CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達上升，且 PHA對 IL-2-和TGF-β+iTreg的誘導比PMA/Ionomycin強。細胞培養(yǎng)16小時后，可以觀察到，在非刺激對照組中，CD4+CD25+FoxP3+IL-2-、CD4+CD25+FoxP3+IL-10+和 CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達與空白對照組中沒有明顯變化(16 h vs 0 h：P=n.s.，見表1～3)，而經(jīng)過PMA/Ionomycin或PHA刺激16小時后，上述iTreg的表達明顯上升(均P＜0.01)，提示表達 IL-2-、IL-10+或 TGF-β+的 CD4+CD25+FoxP3+iTreg經(jīng)多克隆刺激后可以明顯被誘導產(chǎn)生，卻不能被細胞培養(yǎng)液誘導。有意思的是，PHA刺激后CD4+CD25+FoxP3+IL-2-的比例較之PMA/Ionomycin刺激后有明顯的差異(42% vs 27%，P＜0.01，表1)，同樣的情況也可以在CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達上觀察到(33%vs 19%，P＜0.01，表2)，但 PHA 和 PMA/Ionomycin對CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg的刺激卻并沒有顯著的差異(26%vs 19%，P=n.s.，表3)，提示PMA/Ionomycin和 PHA雖然都可以產(chǎn)生 CD4+CD25+FoxP3+iTreg，但刺激的強度并不相同。

2.4PMA/Ionomycin可誘導CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+的表達升高 表4的結(jié)果顯示，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+在nTreg中比例極低，接近于零;經(jīng)過16小時的刺激后，僅PMA/Ionomycin可以成功的誘導產(chǎn)生CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg(vs非刺激對照組：P＜0.01)，而PHA卻不行(vs非刺激對照組：P=n.s.，表4)，提示 PMA/Ionomycin和 PHA 的刺激途徑是不同的。

2.5PMA/Ionomycin刺激后，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg的表達與CD25的水平呈負相關 在空白對照組和非刺激對照組中，無論CD25的表達高或低，都幾乎沒有 CD4+細胞表達 FoxP3+IFN-γ+;而經(jīng)過 PMA/Ionomycin刺激16小時后，CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL的表達明顯上升(均P＜0.01)。有意思的是，將用PMA/Ionomycin刺激16小時后的PBMC根據(jù)CD25的表達水平來設門后發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25-FoxP3+IFN-γ+的 表 達 高 于 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+和 CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+的表達，即誘導產(chǎn)生的 CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL的表達與 CD25呈逆相關(圖3)，且 CD4+CD25-FoxP3+IFN-γ+的 表 達 水 平 與 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+、CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+相比均有顯著性差異(13% ±3.7% vs 3.4% ±2.4%，13% ±3.7%vs 1.4% ±2.0%，均P＜0.01)，但是 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+和CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+相比則無統(tǒng)計學差異(P=n.s.)，這個結(jié)果表明，在多克隆刺激后誘導產(chǎn)生的CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL中，真正具有免疫抑制功能的CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+iTreg只是很少一部分，這也反映了iTreg的多樣性變化。

表1 CD4+CD25+FoxP3+IL-2－iTreg的表達Tab．1 Expression of CD4+CD25+FoxP3+IL-2－ iTreg

表2 CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達Tab．2 Expression of CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg

表3 CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg的表達Tab．3 Expression of CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg

表4 各組CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg占全部CD4+PBL的百分比Tab．4 Proportion of CD4+PBL expressing CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg

圖3 CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL與CD25的表達的關系Fig．3 Relationship between expression of CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL and CD25

3 討論

Treg(尤其是iTreg)的細胞表型多樣性研究一直是Treg相關研究的熱點。在各種文獻報道中，多種細胞標志物被用于表示iTreg的細胞表型，造成在對iTreg進行比較和研究時常常產(chǎn)生誤會。

本實驗，既關注于iTreg的特異性細胞標志物(CD25+、FoxP3+、CD127-)，又關注于非特異性細胞標志物(IL-2-、IL-10+、TGF-β+、IFN-γ+)，通過在體外實驗中多克隆刺激的方式，誘導產(chǎn)生不同細胞表型的iTreg，研究其刺激前后的變化。實驗中，對于全血進行淋巴細胞分離后馬上檢測的新鮮細胞(Fresh cells)的結(jié)果，可以反映血液中nTreg的狀況。通過實驗中可以看出，外周血中細胞表型為CD4+CD25+FoxP3+CD127-的 nTreg約占全部CD4+T細胞的4%左右，這部分nTreg細胞在維持自身的免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。而非特異性細胞標志物在nTreg中的表達同樣非常低，這是因為在靜止狀態(tài)下，機體不分泌或僅分泌少量的細胞因子。只有在細胞活化的時候，細胞內(nèi)合成細胞因子才會增加。要研究細胞因子的變化，必須使用淋巴細胞刺激劑使之活化。

目前最常用的淋巴細胞刺激劑是PMA/Ionomycin和PHA兩種。本實驗研究和比較了兩種激活劑對iTreg的刺激效果，為選擇合適的實驗劑量，在課題預實驗中，我們比較了 PMA(5、10、20 ng/ml)/Ionomycin(0.5、1、2 μg/ml) 和 PHA(90、180、270 μg/ml)等多個劑量對 T 細胞 CD4、CD8、CD25、IL-10、TGF-β、IFN-γ的刺激效果，各濃度間無明顯差異(P=n.s.，具體數(shù)據(jù)未顯示)，均可視為對淋巴細胞充分刺激。

本實驗結(jié)果顯示，PMA/Ionomycin和PHA均可以有效的刺激靜止的淋巴細胞活化，并誘導產(chǎn)生iTreg。值得注意的是，這二者刺激的效果并不一樣，對表達 IFN-γ的 Treg誘導過程中可以發(fā)現(xiàn)，PMA/Ionomycin可以有效的刺激產(chǎn)生CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg，而PHA則不能誘導產(chǎn)生;而對于表達IL-2-和TGF-β+的Treg的誘導過程中可以看到，PMA/Ionomycin和PHA對iTreg的刺激力度是不一樣的，提示PMA/Ionomycin和PHA對淋巴細胞的刺激有不同的作用途徑。另外，以PMA/Ionomycin作為激活劑對淋巴細胞進行刺激會顯著降低CD4分子的表達(本實驗中，刺激前54%的CD3+T細胞表達CD4+，而刺激后僅16%，具體數(shù)據(jù)未顯示)，這嚴重影響到后續(xù)實驗中以CD4+細胞設門分析iTreg的表達。因此，有報道指出，可以用CD3+CD8-T細胞設門來代替 CD3+CD4+T 細胞［14］;但是，我們在以非CD4組合抗體(Cocktail sets)和CD8抗體進行比較后發(fā)現(xiàn)，PMA/Ionomycin刺激后的淋巴細胞表達CD3+CD4-的細胞并非全部表達CD3+CD8+(具體數(shù)據(jù)未顯示)，即CD3+CD8-T細胞也并不能代替CD3+CD4+T細胞，它還包括有自然殺傷細胞(NK細胞)和部分CD3+CD8-CD4-細胞。有意思的是，雖然PMA/Ionomycin刺激后會降低CD4+的表達，但是刺激后CD4+iTreg的表達卻明顯升高，各種特異性和非特異性的細胞標志物均明顯升高。同時，對于本實驗所觀測幾項指標，除了CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg外，其余的細胞標志物在受到PHA的刺激后升高的程度比PMA/Ionomycin更高，這為進一步的分選擇iTreg或功能實驗提供了一種新的選擇。另外，經(jīng)過PMA/Ionomycin或PHA刺激后，流式細胞檢測時會發(fā)現(xiàn)PBMC與刺激前出現(xiàn)了明顯的變化，表現(xiàn)為淋巴細胞群與單核細胞群出現(xiàn)明顯的重疊，并由于染色過程中破膜，使得細胞變小、顆粒減少，在FSC-SSC散點圖上表現(xiàn)為細胞群向左下移動、聚集，而不易圈出明顯的淋巴細胞群。

在所有細胞因子中，分泌IL-10、TGF-β及缺乏IL-2一直被公認為是與iTreg的發(fā)育和功能密切相關，本實驗也觀測到 CD4+CD25+FoxP3+IL-2-iTreg、CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg 和 CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg在受到刺激后表達明顯升高。IFN-γ是一類比較特殊的細胞因子。雖然幾乎所有的淋巴細胞都可以產(chǎn)生IFN-α和IFN-β，但是只是活化T細胞和NK細胞才能產(chǎn)生IFN-γ。以前，IFN-γ被認為是Th1細胞的標志性細胞因子，但是后來又發(fā)現(xiàn)Treg和CD8+T細胞同樣可以產(chǎn)生IFN-γ，且IFN-γ在抗炎癥、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。

近來，德國Daniel研究組(筆者作為主要研究者參與其中)陸續(xù)報道，表達IFN-γ的CD4+iTreg和腎移植術后患者移植腎功能長期存活密切相關。在對腎移植術后患者的長期隨訪監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，與移植腎功能受損的患者相比，移植物功能良好的患者體內(nèi)表達 IFN-γ的 CD4+Treg(CD3+CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+)數(shù)量明顯升高，提示 IFN-γ 也許在誘導人移植物免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用，并認為CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg的免疫抑制功能可能是IFN-γ依賴性的［15-17］。本實驗觀察到，雖然PMA/Ionomycin刺激后，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg的表達會明顯升高，但是其表達水平與CD25的水平呈逆相關，雖然 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+和 CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+的水平無明顯差異，但是隨著CD25水平的升高，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg占所有CD4+T細胞的百分比越低，這也許表明真正具有免疫抑制功能的CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg在外周血中含量極低。值得探討的是，雖然也有文獻報道刺激后的CD4+CD25-T細胞表達FoxP3+，且同樣會產(chǎn)生活化的細胞因子［18］，但本實驗中觀察到的部分細胞刺激后表達為 CD4+CD25-FoxP3+IFN-γ+，是否全部為誘導性的CD4+CD25-T細胞，是否包括部分的自然殺傷T細胞(NKT細胞)，這些都值得進一步的深入研究。

綜上所述，本實驗通過使用PMA/Ionomycin和PHA對人PBMC進行多克隆刺激后可以誘導產(chǎn)生iTreg。不同細胞表型的iTreg反映了人調(diào)節(jié)性T細胞的多樣性變化，同時細胞表型中表達或不表達的細胞因子與iTreg的作用機制可能密切相關;實驗中同時發(fā)現(xiàn)PMA/Ionomycin和PHA對人iTreg誘導的機制和程度不一樣。這些實驗結(jié)果將有利于進一步開展人iTreg的功能實驗，并最終將人iTreg的實驗成果應用于臨床的診斷和治療實踐中。

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