許益聘 綜述 葉信海 審校

視神經(jīng)損傷是眼外傷最嚴(yán)重的后果之一，在眼外傷中占較大的比例。急性視神經(jīng)損傷在臨床較為常見，如果缺乏及時有效的救治，半數(shù)患者最終將喪失視力[1]。視神經(jīng)損傷后，視功能的恢復(fù)程度主要取決于視網(wǎng)膜節(jié)細胞（Retinal ganglion cells，RGCs）的存活數(shù)量和軸突的再生情況[2]。視神經(jīng)損傷后的修復(fù)再生是一個復(fù)雜的生理生化過程，機制尚未明確。因此，如何最大限度地修復(fù)患者損傷的視神經(jīng)，以期達到功能重建，提高患者的生存質(zhì)量，對恢復(fù)患者正常的工作、生活具有重要意義。尋找促進視神經(jīng)再生和修復(fù)的有效方法已成為現(xiàn)代神經(jīng)生物領(lǐng)域的研究熱點，研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路的表達對視神經(jīng)再生有重要作用。

1 mTOR的結(jié)構(gòu)

雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）是1991年Heitman等[3]在分析雷帕霉素對不同酵母菌的作用時發(fā)現(xiàn)的，廣泛存在于哺乳動物中，進化十分保守。人的mTOR基因位于染色體1p36.2上，其mRNA翻譯后的蛋白質(zhì)有2549個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為289 KD。mTOR的結(jié)構(gòu)域從氨基端到羧基端依次為HEAT重復(fù)序列、FAT結(jié)構(gòu)域、FRB激酶結(jié)構(gòu)域、NRD及FATC結(jié)構(gòu)域?？拷黰TOR的C端有一個激酶結(jié)構(gòu)域，約234個氨基酸殘基，其結(jié)構(gòu)和磷脂酰肌醇3-激酶(PIKK)的催化域相似，是mTOR屬于PIKK蛋白激酶類家族的重要原因之一。緊挨著激酶結(jié)構(gòu)域上游的是FRB（FKBP12-rapamycin binding）結(jié)構(gòu)域，它是 FKBP12-rapamycin復(fù)合物的結(jié)合位點，在雷帕霉素特異性抑制mTOR中起著連接作用。雷帕霉素可與細胞內(nèi)的受體FKBP12結(jié)合形成FKBP-rapamycin復(fù)合物，再與mTOR的FRB區(qū)相結(jié)合，從而抑制mTOR的激酶活性[4]。

2 mTOR信號傳導(dǎo)途徑

2.1 上游信號傳導(dǎo)途徑

mTOR的上游信號傳導(dǎo)主要通過PI3K/Akt/mTOR途徑和非依賴PI3K/Akt途徑，以實現(xiàn)對細胞生長、細胞周期等多種生理功能的調(diào)控。

2.1.1 經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑—PI3K/Akt/mTOR信號通路

活化的磷酸肌醇 3激酶 （Phosphoinositide 3-kinases，PI3K）能磷酸化磷脂酰肌醇二磷酸鹽（Phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate，PIP2）并轉(zhuǎn)變?yōu)榱字＜〈既姿猁}（Phosphatidylinositol 3,4,5 trisphosphate，PIP3）。后兩者仍然位于細胞膜，并召集下游分子Akt到細胞膜上。PIP3可以召集并激活磷脂酰肌醇依賴性激酶-1（Phosphatidylinositol-dependent kinase 1/2，PDK-1），從而使 Akt磷酸化并激活[5]。 另外，PTEN對 PI3K有反饋調(diào)節(jié)作用，催化PIP3轉(zhuǎn)化為PIP2，從而負調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性[6]。因此，PTEN的失活能促使PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，激活A(yù)kt和mTOR。

正常情況下，結(jié)節(jié)性腦硬化復(fù)合物-1（TSC-1）和TSC-2形成二聚體復(fù)合物，是小GTP酶Rheb（Rashomolog enriched in brain）的抑制劑，而Rheb是mTOR活化所必需的刺激蛋白，因此TSC-1/TSC-2在正常情況下抑制mTOR的功能。當(dāng)Akt活化后，可磷酸化TSC-2而抑制TSC-1/TSC-2復(fù)合物的形成，從而解除了對Rheb的抑制作用，使得mTOR被激活[7]。

2.1.2 非依賴 PI3K/Akt途徑

研究發(fā)現(xiàn)，AMPK（AMP-activated protein kinase A）與mTOR的活性調(diào)節(jié)有關(guān)。在哺乳動物細胞系中，氨基酸的代謝調(diào)節(jié)不是通過PI3K/Akt/mTOR通路來實現(xiàn)的，而是直接通過LKB1/AMPK/mTOR通路來調(diào)節(jié)。在細胞中，當(dāng)ATP/ADP比率下降時，AMP的水平變化比ATP的變化更為敏感。AMPK則對細胞內(nèi)非常細微的AMP濃度變化十分敏感[8]。在缺乏能量的細胞內(nèi)，AMPK可以直接磷酸化并提高TSC-2的活性，促進TSC-1/TSC-2復(fù)合物形成，抑制Rheb酶活性，從而間接抑制mTOR通路的活性[9]。AMPK在能量壓力下還可以直接磷酸化mTOR[10]。

2.2 下游效應(yīng)器

真核細胞翻譯啟始因子4E結(jié)合蛋白（4E-BP）和p70核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）是mTOR下游最具特色的兩個效應(yīng)器，形成了平行調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)譯的兩條信號通路。

4EBP1（eIF4E-binding protein 1）的 mRNA中含有從DNA中轉(zhuǎn)錄得到的遺傳信息，是蛋白質(zhì)生物合成的模板。在真核生物蛋白質(zhì)合成的起始階段，由于5’端mRNA的特殊帽狀結(jié)構(gòu)，核糖體不能直接與mRNA相結(jié)合，而是需要翻譯起始因子的幫助。eIF-4E又稱為帽結(jié)合蛋白（Cap-binding protein，CBP），它與mRNA的5’帽結(jié)構(gòu)結(jié)合后再與eIF-4G結(jié)合，eIF-4G作為一種支架蛋白募集eIF-4A形成三聚體復(fù)合物eIF-4F，而此復(fù)合物可以使核糖體結(jié)合到mRNA上從而起始蛋白質(zhì)的翻譯。4EBP1有同eIF-4G相似的eIF-4E識別序列，故4EBP1、eIF-4G與eIF-4E的結(jié)合存在部分重疊，4EBP1可以通過競爭性抑制eIF-4G與eIF-4E的結(jié)合來達到抑制翻譯起始的作用。mTOR信號通路通過磷酸化4EBP1，使eIF-4E與其解離并活化，促使翻譯起始復(fù)合物的形成，從而加速蛋白質(zhì)的合成。相反，當(dāng)生長因子或營養(yǎng)素缺乏，或者有mTOR抑制物存在時，4EBP1去磷酸化，并與eIF-4E結(jié)合從而抑制翻譯起始[11]。

p70S6K是核糖體40S小亞基S6蛋白激酶，可激活S6；而 S6可以提高含 5’-TOR（5'-terminal oligopyrimidine tract）的一類mRNA的翻譯效率。這類5’-TOR mRNA約占總mRNA的20%，它的翻譯產(chǎn)物包括許多翻譯元件成分如核糖體蛋白、延伸因子EF1ɑ等。mTOR可以磷酸化并激活S6K1，使核糖體40S小亞基易于結(jié)合翻譯復(fù)合物，并提高5’-TOR mRNA的翻譯效率[12]。

3 mTOR信號通路與視神經(jīng)再生的關(guān)系

成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，神經(jīng)元不會再生。這是因為中樞神經(jīng)細胞外環(huán)境中的抑制因子和成熟CNS再生能力的減弱[13-16]。隨著細胞外抑制因子的清除，損傷部位周圍只能出現(xiàn)一定量的軸突再生[17-19]。而細胞內(nèi)在的再生能力對軸突再生起著決定性作用。在哺乳動物發(fā)育期過后，大部分的成熟神經(jīng)細胞常表達一些抑制細胞生長的因子[20]。有研究通過向成年小鼠玻璃體腔內(nèi)注射表達腺病毒的方法敲除特異性基因，來觀察細胞因子對視神經(jīng)再生的影響，其中包括 Rb、P53[21]、Smad4[22]、Dicer[23]、LKB1[24]和 PTEN[25]。 在注射病毒2周后，制造視神經(jīng)擠壓傷，觀察損傷后視網(wǎng)膜節(jié)細胞（Retinal ganglion neurons，RGCs）存活數(shù)目及軸突再生情況。結(jié)果顯示，PTEN的敲除能使RGCs存活數(shù)目增多，并且在損傷14 d后能觀察到RGCs軸突纖維有較長距離的再生。損傷2周后敲除PTEN的RGCs的存活數(shù)目為45%，與對照組的20%相比有明顯增多。8%～10%RGCs的軸突向損傷中心生長長度超過了0.5 mm，部分甚至超過3 mm。這些再生神經(jīng)纖維能沿著視神經(jīng)繼續(xù)生長，在損傷4周后能延伸到視交叉。在其他敲除基因中，只有p53的敲除能誘導(dǎo)增加RGCs存活數(shù)目，但并沒有出現(xiàn)軸突纖維再生。從而可以看出RGCs的存活數(shù)目的增多并不一定會同時出現(xiàn)視神經(jīng)再生[26]。

PTEN的敲除能激活PI3k/mTOR信號通路，然后該信號通路通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成從而控制細胞的生長和大小。mTOR的下游傳導(dǎo)途徑主要為核糖體S6激酶1(S6K1)和4EBP1。S6K1的功能是磷酸化核糖體蛋白S6(p-S6)，故可以利用p-S6的抗體來監(jiān)測mTOR信號通路活化。在胚胎時期的神經(jīng)元細胞中可觀察到高水平表達的p-S6，但在90%的成熟RGCs中p-S6表達明顯減少。這證明大部分成熟RGCs的mTOR信號通路是處于失活狀態(tài)的，只有少部分RGCs保留著mTOR通路的活化。然而當(dāng)視神經(jīng)軸突斷裂損傷后，RGCs的p-S6完全被抑制，表明視神經(jīng)損傷可進一步抑制mTOR通路的激活。這不僅僅與損傷直接相關(guān)，也與損傷后的缺氧狀態(tài)及Redd1/2信號的上調(diào)等因素相關(guān)[26-29]。

成年小鼠在PTEN基因敲除的誘導(dǎo)作用下，視神經(jīng)RGCs的p-S6表達水平未見提高，然而遭受視神經(jīng)擠壓損傷后可觀察到與未損傷時相接近的p-S6表達水平。盡管軸突經(jīng)歷了損傷的應(yīng)激反應(yīng)，敲除PTEN的神經(jīng)元仍能保持與未損傷時相接近的mTOR激活比例，并且出現(xiàn)軸突再生的RGCs數(shù)目比例與未損傷時相接近。

在PTEN敲除誘導(dǎo)成熟RGCs軸突再生作用中，mTOR通路的活化也是非常必要的。通過抑制mTOR通路的激活來觀察軸突再生情況的實驗顯示，隨著mTOR的抑制劑雷帕霉素的應(yīng)用，RGCs內(nèi)的p-S6水平明顯降低，抵消了神經(jīng)元的存活數(shù)目增多及軸突再生，證明了mTOR在敲除PTEN后出現(xiàn)的視神經(jīng)再生中起到關(guān)鍵作用。但仍能觀察到少量的軸突再生纖維，這可能與PTEN的其他下游傳導(dǎo)途徑相關(guān)。

mTOR的另一個負調(diào)節(jié)通道TSC1/2能抑制mTOR的激活，但TSC1或TSC2中任一個缺失都將導(dǎo)致mTOR通路的激活[30-32]。在敲除TSC1的成年RGCs遭受視神經(jīng)損傷后，RGCs的p-S6水平提高，并且RGC存活數(shù)目明顯增多。最重要的是，敲除TSC1的視神經(jīng)中觀察到相應(yīng)的軸突再生，但軸突的再生程度比起敲除PTEN所誘導(dǎo)的要弱一些。而對照組未見到軸突再生。因此，mTOR信號通路能有效地促進RGCs的存活及軸突再生。

綜上所述，mTOR信號通路及所調(diào)控的蛋白質(zhì)翻譯在視神經(jīng)損傷后的軸突再生中起到重要作用。在成熟神經(jīng)元損傷后，mTOR信號通路處于失活狀態(tài)，并抑制了軸突再生所需蛋白質(zhì)的合成。通過敲除PTEN或TSC1基因的方法可誘導(dǎo)軸突再生所需的蛋白質(zhì)合成，從而促進RGCs軸突再生。但現(xiàn)有的研究尚處于初步階段，其具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)機制及與視神經(jīng)再生發(fā)生機制更詳細的關(guān)系還有待深入研究。

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