鄒學(xué)農(nóng)，陳大福，田 偉，張西正，吳 剛，董 華，周永勝，周光前

(1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科研究所，廣東廣州510080)

(2.北京積水潭醫(yī)院創(chuàng)傷骨科研究所，北京100035)

(3.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所，天津300161)

(4.華南理工大學(xué)國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006)

(5.北京大學(xué)口腔醫(yī)院，北京100081)

(6.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳518060)

硬組織修復(fù)材料的骨再生機(jī)理研究

鄒學(xué)農(nóng)1，陳大福2，田 偉2，張西正3，吳 剛4，董 華4，周永勝5，周光前6

(1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科研究所，廣東廣州510080)

(2.北京積水潭醫(yī)院創(chuàng)傷骨科研究所，北京100035)

(3.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所，天津300161)

(4.華南理工大學(xué)國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006)

(5.北京大學(xué)口腔醫(yī)院，北京100081)

(6.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳518060)

傳統(tǒng)硬組織修復(fù)材料由于在組成及結(jié)構(gòu)上與人體骨組織存在較大差異，植入體內(nèi)后的骨組織修復(fù)過程基本上是一種被動(dòng)的“充填”過程，且材料的降解速度與新骨形成速度不匹配，難以達(dá)到真正的“生物性融合”，嚴(yán)重制約了該類材料在骨科臨床的推廣應(yīng)用。因此，設(shè)計(jì)與制備具有“主動(dòng)修復(fù)功能”和“可調(diào)控生物響應(yīng)特性”的第3代新型硬組織修復(fù)材料已成為當(dāng)前骨科臨床的新需求和未來的發(fā)展方向。介紹了硬組織修復(fù)材料的骨再生機(jī)理研究方法，綜述了硬組織修復(fù)材料與宿主防御和骨再生及宿主微環(huán)境對(duì)材料與宿主細(xì)胞相互作用的研究現(xiàn)狀。指出硬組織修復(fù)材料植入體內(nèi)后所發(fā)生的序列事件可能通過表觀遺傳修飾使得基因表達(dá)受材料本身和宿主微環(huán)境等因素的調(diào)控，提出新型硬組織修復(fù)材料研究中存在的問題和發(fā)展趨勢(shì)。

硬組織修復(fù)材料;骨再生;宿主防御;宿主微環(huán)境;表觀遺傳學(xué);基因調(diào)控

1 前言

生物醫(yī)用材料應(yīng)用于硬組織修復(fù)及功能替代，已有幾十年的時(shí)間，如人工骨替代材料、人工關(guān)節(jié)假體、種植牙等。此類材料在臨床應(yīng)用中的生物安全性雖然已基本確定，但一些材料與宿主骨結(jié)合界面可形成纖維層包裹或界面結(jié)合強(qiáng)度低，導(dǎo)致應(yīng)力遮擋、植入體松動(dòng)并脫落、植入物失效等問題。20世紀(jì)70年代隨著生物玻璃和羥基磷灰石(HA)等硬組織活性材料的研發(fā)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到植入材料與宿主骨界面能夠通過化學(xué)鍵合形成骨性結(jié)合，骨組織修復(fù)以“爬行替代”方式通過骨傳導(dǎo)作用(Osteoconduction)實(shí)現(xiàn)與宿主骨組織的融合［1］。鑒于傳統(tǒng)的第一、二代硬組織修復(fù)材料的缺點(diǎn)，有學(xué)者提出構(gòu)建具有離子或分子溶出或利用材料中生物活性分子在基因水平上，激活特定細(xì)胞反應(yīng)的可降解生物活性材料，迅速引起了國內(nèi)外生物材料研究領(lǐng)域的廣泛興趣［2］。此類具有“主動(dòng)修復(fù)功能”和“可調(diào)控生物響應(yīng)特性”的第三代硬組織修復(fù)材料，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)和未來的發(fā)展方向。

大量臨床隨訪研究表明，臨床上傳統(tǒng)的硬組織修復(fù)材料植入體內(nèi)后，因其在組成及結(jié)構(gòu)上與人體骨組織存在較大差異，骨組織修復(fù)過程基本上是一種被動(dòng)的“充填”過程，且材料的降解速度與新骨形成速度不匹配，難以達(dá)到真正的“生物性融合”、形成牢固的生物學(xué)界面，導(dǎo)致植入體在宿主體內(nèi)一定時(shí)間后會(huì)發(fā)生松動(dòng)、脫落、老化、腐蝕等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響硬組織修復(fù)的效果。例如，脊柱融合失敗及假關(guān)節(jié)的發(fā)生率高達(dá)5%～35%;金屬全髖關(guān)節(jié)置換10年后的總翻修率高達(dá)4%以上。主要原因在于，一方面由于材料植入體內(nèi)后所引發(fā)宿主的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、組織再生修復(fù)的序列事件并不完全清楚，另一方面宿主微環(huán)境(力學(xué)、化學(xué)、炎癥)對(duì)植入材料與宿主組織細(xì)胞的相互作用及植入材料在骨再生過程中的轉(zhuǎn)歸行為等諸多復(fù)雜問題尚未完全明了，制約了新型硬組織修復(fù)材料的研究、開發(fā)和應(yīng)用。作者在本文中對(duì)硬組織修復(fù)材料的骨再生機(jī)理研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述，同時(shí)提出了新型硬組織修復(fù)材料設(shè)計(jì)與制備研究中存在的問題和可能的解決辦法。

2 硬組織修復(fù)材料與宿主防御和骨再生體系的相互作用

2.1 硬組織修復(fù)材料植入宿主后所發(fā)生的序列事件

骨形成有兩種不同的方式:軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨。大部分骨骼如長骨的形成經(jīng)過軟骨內(nèi)成骨，即軟骨中間期。少數(shù)骨如頭蓋骨的形成僅膜內(nèi)成骨，即直接從間葉組織的聚集形成骨組織。一般來說，硬組織修復(fù)材料植入宿主后，將經(jīng)歷與正常骨折愈合相似的3個(gè)階段，即炎癥期、修復(fù)期和塑形期。但由于材料本身及其所介導(dǎo)的宿主防御和骨再生體系的相互作用，硬組織修復(fù)材料植入宿主后所發(fā)生的序列事件，較正常的骨折愈合過程更為復(fù)雜。目前，只有通過動(dòng)物模型對(duì)這一過程進(jìn)行系統(tǒng)研究，才能弄清硬組織修復(fù)材料植入宿主后與宿主防御和骨再生體系的相互作用。

在以往的研究中，系通過建立家豬腰椎前路椎間融合的動(dòng)物模型，將分別載有馬骨膠原蛋白提取物(COLLOSS?E)、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2/可吸收性牛I型膠原海綿(rhBMP-2/ACS，INFUSE?)或自體骨的椎間融合器，隨機(jī)植入腰3/4、腰4/5、腰5/6椎間隙，術(shù)后2周、4周、8周進(jìn)行磁共振成像(MRI)和正電子發(fā)射斷層顯像(PET/CT)掃描，觀察3種不同材料在脊柱融合炎癥期、修復(fù)期和塑形期所發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化;動(dòng)物處死后取標(biāo)本進(jìn)行顯微CT掃描、組織學(xué)與組織形態(tài)計(jì)量分析，提取總RNA進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片和microRNA芯片檢查。結(jié)果顯示，3種不同材料在脊柱融合過程中骨形成的表現(xiàn)方式不同，如COLLOSS?E和自體骨移植呈現(xiàn)軟骨內(nèi)成骨，而rhBMP-2促使類骨質(zhì)直接沉積于膠原網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)為膜內(nèi)成骨［3］;3種不同材料在脊柱融合過程中所形成的新骨三維結(jié)構(gòu)也有明顯區(qū)別，且不同材料移植早期發(fā)生的炎性水腫、組織腫脹、新骨形成過多等不良事件的程度不同［4］;3種不同材料植入宿主后與不同階段的炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)如自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用、抗原提呈相關(guān)通路、T細(xì)胞受體通路及Toll樣受體通路等呈現(xiàn)時(shí)序變化規(guī)律且相互重疊;3種不同材料在脊柱融合過程中，經(jīng)不同的成骨方式促使脊柱融合的分子事件也不同，如在炎癥期rhBMP-2明顯上調(diào)PGHS-2，IGFBP-2和IGF-2等多種因子表達(dá)誘導(dǎo)骨前體細(xì)胞募集、增殖與分化導(dǎo)致膜內(nèi)成骨，在塑形期明顯上調(diào)釉原蛋白基因促進(jìn)骨塑形;而COLLOSS? E(主要為I型膠原蛋白)和自體骨在炎癥期下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)基因表達(dá)抑制成血管作用，從而減少BMP誘導(dǎo)的膜內(nèi)成骨，在修復(fù)期上調(diào)募集的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)成軟骨分化相關(guān)基因CTGF與 COMP表達(dá)和基質(zhì)礦化相關(guān)基因MGP與COL10A1表達(dá)引起軟骨內(nèi)成骨［5］;作為一類重要的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控因子，miRNA參與了脊柱融合過程中廣泛的生物學(xué)過程，3種不同材料植入體內(nèi)后所發(fā)生的分子序列事件的特異性基因表達(dá)受miRNA的調(diào)控，這些miRNA包括miR-181c， miR-363， miR-140， miR-224， miR-99b， miR-935，miR-455，miR-10a，miR-29c，miR-486，miR-127，miR-206，miR-19a，miR-450c等(未發(fā)表數(shù)據(jù))。由此可見，硬組織修復(fù)材料植入宿主后所介導(dǎo)的宿主防御和骨再生過程，涉及炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、血管生成、骨前體細(xì)胞遷移、增殖與分化、成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞活動(dòng)等宿主體內(nèi)應(yīng)答的序列事件，將啟動(dòng)一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控和表觀遺傳學(xué)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)骨組織再生修復(fù)或?qū)е轮踩胛锸?圖1)。

表觀遺傳學(xué)是研究非DNA序列變化的、可遺傳的、影響基因表達(dá)的科學(xué)，表觀遺傳學(xué)機(jī)制參與個(gè)體發(fā)育、干細(xì)胞分化等許多生物學(xué)過程以及表觀遺傳學(xué)機(jī)制(DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、miRNA等)的調(diào)控。在成骨模型中，Rb(Retinoblastoma)蛋白作為協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子，可以增強(qiáng)Runx2的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)成骨［6］，H3K4去甲基化酶視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白2(Retinoblastoma Binding Protein 2，RBP2)可以拮抗Rb而抑制成骨細(xì)胞分化［7－8］。最近研究發(fā)現(xiàn)，RBP2依賴于其組蛋白去甲基化酶活性抑制重要成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2的功能，從而削弱了人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hASCs)向成骨細(xì)胞分化的能力［9］。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)單胺去氧化酶家族類的去甲基化酶LSD1與Runx2物理上存在相互作用。體內(nèi)外試驗(yàn)表明，LSD1的功能缺失顯著促進(jìn)了hASCs的成骨向分化，提示LSD1、RBP2如組蛋白修飾所介導(dǎo)的表觀遺傳機(jī)制，可能在hASCs的成骨向分化中有著重要作用。因此，采用表觀遺傳學(xué)理論和技術(shù)，研究硬組織修復(fù)材料對(duì)細(xì)胞生長分化以及組織再生修復(fù)序列事件的影響，能更深入全面地揭示硬組織修復(fù)材料在骨再生過程中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

圖1 骨修復(fù)材料植入宿主后宿主防御與骨再生體系的相互關(guān)系Fig.1 Relationship between host defense responses and bone regeneration system after the implantation of bone repair materials

2.2 硬組織修復(fù)材料與干細(xì)胞的相互作用

如前所述，不同材料植入宿主后MSCs募集、增殖與分化事件出現(xiàn)的時(shí)序不同，導(dǎo)致了骨形成方式的不同。因此，新型硬組織修復(fù)材料在設(shè)計(jì)之初，就需要考慮是否真正具備誘導(dǎo)骨再生的能力，該類材料與干細(xì)胞的相互作用被認(rèn)為是導(dǎo)致骨再生的一個(gè)重要因素，而體外評(píng)價(jià)是可靠實(shí)用的實(shí)驗(yàn)研究方法。Levenberg等［10－11］體外培養(yǎng)證實(shí)干細(xì)胞接種于支架材料，能促進(jìn)干細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)功能，通過支架材料表面生物學(xué)功能的模擬，可在體內(nèi)外誘導(dǎo)組織或器官的形成。例如，RGD序列為人纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)與其受體的結(jié)合位點(diǎn)。采用RGD序列修飾聚合物三維支架表面，可改善細(xì)胞在材料上的粘附［12］、介導(dǎo)FAK-PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路參與聚已內(nèi)酯(Polycaprolactone，PCL)三維支架材料表面與骨髓MSCs的相互作用［13］;而整合素-α修飾的BCP/PCL-nHA三維支架表面，可激活ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，在誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成骨分化中起著重要作用［14］;在PCL三維支架表面自組裝透明質(zhì)酸、甲基膠原與共聚物復(fù)合膜，可改善干細(xì)胞在支架材料內(nèi)的接種效率、分布與成骨分化的能力［15］。此外，三維支架材料的孔徑也影響與干細(xì)胞的相互作用，如孔徑200 μm珊瑚羥基磷灰石加速hMSCS成骨分化，但孔徑500 μm珊瑚羥基磷灰石增加細(xì)胞增殖率與細(xì)胞數(shù)［16］。而三維結(jié)構(gòu)較二維結(jié)構(gòu)更易感受壓力信號(hào)而激活p38、JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)接種于磷酸鈣(CP)支架材料中胚胎干細(xì)胞向成骨分化［17］;金屬Ti表面微結(jié)構(gòu)通過Wnt信號(hào)分子(Dkk1和Dkk2)和信號(hào)傳導(dǎo)通路(Wnt/Ca2+)影響干細(xì)胞成骨分化和成骨細(xì)胞成熟［18－19］。由于不同硬組織修復(fù)材料本身的組成、形態(tài)結(jié)構(gòu)、孔徑與孔隙率、表面及機(jī)械強(qiáng)度等獨(dú)立信號(hào)千差萬別，因此，建立新型硬組織修復(fù)材料的干細(xì)胞分化快速篩選平臺(tái)，在基因水平上篩選具有激活特定干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的材料學(xué)因素，將有利于加速新型硬組織修復(fù)材料的設(shè)計(jì)、開發(fā)和應(yīng)用。

2.3 建立新型硬組織修復(fù)材料的干細(xì)胞分化快速篩選平臺(tái)

硬組織修復(fù)材料與干細(xì)胞的相互作用，促使生長因子整合和細(xì)胞粘附［10－11］。除 BMPs和 TGF-β 外，涉及低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxic Inducible Factor-1，HIF-1ɑ)，F(xiàn)GF，Wnt，Notch，hedgehogs，F(xiàn)GF，IGFs，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1α)/CXCR4等多重信號(hào)通路及其下游信號(hào)分子的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終激活成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix(Osx)等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控MSCs及骨前體細(xì)胞分化和骨形成［20－22］。軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨都需要Runx2的參與，MSCs向成骨細(xì)胞分化受Indian Hedgehog(Ihh)，Runx2，Osx和 Wnt/β-catenin信號(hào)通路等各種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)蛋白調(diào)控［23］。Ihh屬于Hedgehog家族，它對(duì)軟骨內(nèi)成骨和Runx2的激活是必需的［24］。Runx2參與 MSCs向骨前體細(xì)胞分化［25］。Osx是Runx2的下游基因，在成骨細(xì)胞表達(dá)但在前肥大軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，Osx在骨前體細(xì)胞分化為成熟的成骨細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。Osx敲除胚胎能形成軟骨但無骨形成及成骨標(biāo)志基因如骨鈣素、骨唾液酸蛋白、堿性磷酸酶等的表達(dá)［26］。Wnt信號(hào)通路實(shí)際上涉及多個(gè)細(xì)胞受體和配體分子，其主要下游信號(hào)分子β-Catenin在成骨分化的不同階段起不同甚至相反的作用，而Osx能抑制Wnt信號(hào)通路及其下游特異性基因的表達(dá)，參與骨形成的負(fù)反饋調(diào)控途徑［20］。因此，Osx被認(rèn)為是控制成骨細(xì)胞分化的分子開關(guān)，缺乏Osx的激活將無新骨形成［20，26］。隨著對(duì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化與Osx及其下游靶標(biāo)和信號(hào)通路研究的不斷深入，將有助于建立新型硬組織修復(fù)材料的干細(xì)胞分化快速篩選平臺(tái)。

3 硬組織修復(fù)材料與宿主微環(huán)境的相互作用及轉(zhuǎn)歸

硬組織修復(fù)材料與宿主微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用，趨向一個(gè)主動(dòng)修復(fù)過程，可能受宿主微環(huán)境因素如力學(xué)微環(huán)境、炎癥微環(huán)境和化學(xué)微環(huán)境(如pH值、氧分壓等)的影響或作用，也受到材料在組織再生過程中轉(zhuǎn)歸行為的影響。

3.1 硬組織修復(fù)材料與宿主微環(huán)境和宿主細(xì)胞的相互作用

3.1.1 力學(xué)微環(huán)境對(duì)硬組織修復(fù)材料與骨骼細(xì)胞功能的影響

力學(xué)微環(huán)境是生物體硬組織所必需的，骨組織的力學(xué)微環(huán)境是流體、應(yīng)變耦合的物理?xiàng)l件，對(duì)骨組織形成的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中MSCs、骨祖細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞均有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，接種于靜電紡絲PCL三維支架中的成骨細(xì)胞經(jīng)10%壓縮應(yīng)力刺激后，成骨相關(guān)蛋白(BMP-2、骨鈣素)和骨基質(zhì)相關(guān)蛋白(骨橋蛋白、骨連接蛋白)或基因的表達(dá)均上調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)也較對(duì)照組增多，支架的彈性模量也比無細(xì)胞支架增加了約5倍［27］。成骨細(xì)胞－聚氨酯(Polyurethane，PU)三維支架復(fù)合物經(jīng)1Hz、5%的壓縮應(yīng)力刺激后，膠原、鈣含量顯著增加，支架復(fù)合物硬度增強(qiáng)［28］。Dumas等向人骨瘤細(xì)胞－羥基磷灰石三維支架復(fù)合物施加3Hz、5N(1μm)的壓縮應(yīng)力刺激，發(fā)現(xiàn)膠原和FN微弱上調(diào)，但細(xì)胞－支架復(fù)合物經(jīng)25Hz壓縮刺激后，膠原和FN顯著上調(diào);另外，較高頻率的壓縮刺激可增加支架ECM結(jié)合VEGF的量［29］，可能有利于血管化。Sittichockechaiwut等向成骨樣細(xì)胞MLOA5/PU多孔支架施加周期性壓縮應(yīng)力，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨特異性基因/蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，骨礦化基質(zhì)的形成也明顯增多［28］。上述研究雖涉及體外載荷作用下生物活性材料與細(xì)胞復(fù)合體的轉(zhuǎn)歸行為，但體內(nèi)力學(xué)微環(huán)境對(duì)生物活性材料/細(xì)胞復(fù)合體影響還遠(yuǎn)未闡明。

力學(xué)載荷對(duì)骨骼細(xì)胞功能的影響，是通過多重信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的相互作用來調(diào)控的。成骨及破骨細(xì)胞對(duì)應(yīng)力環(huán)境的響應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一系列生化事件的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，包括蛋白質(zhì)的修飾(主要是磷酸化)、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用、以及下游靶基因表達(dá)的改變等。作者采用基因芯片與蛋白質(zhì)組學(xué)高通量篩選技術(shù)，研究力學(xué)載荷對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的影響，生理載荷作用下，發(fā)現(xiàn)1 992個(gè)差異表達(dá)的基因，涉及123個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變;超生理作用下，發(fā)現(xiàn)1 435個(gè)差異表達(dá)的基因，涉及101條信號(hào)傳達(dá)通路的變化，骨密切相關(guān)的近30條信號(hào)傳導(dǎo)通路(未發(fā)表數(shù)據(jù))與文獻(xiàn)報(bào)道［30］一致。應(yīng)用SELDI-TOF MS技術(shù)(又稱蛋白指紋圖譜技術(shù))篩選結(jié)果顯示，有41種蛋白質(zhì)在應(yīng)力作用下，發(fā)生了明顯、穩(wěn)定的質(zhì)和量的改變，經(jīng)質(zhì)譜鑒定實(shí)際有37種蛋白質(zhì)發(fā)生變化，其中明確與骨生長發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)有12個(gè)。上述結(jié)果表明，力學(xué)載荷對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞具有重要影響，但在力學(xué)作用下硬組織修復(fù)材料與骨骼細(xì)胞功能的影響有待進(jìn)一步研究。

3.1.2 炎癥微環(huán)境對(duì)硬組織修復(fù)材料與骨骼細(xì)胞功能的影響

炎癥微環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響非常復(fù)雜，涉及多種炎癥因子介導(dǎo)的信號(hào)通路激活或抑制，是細(xì)胞生物學(xué)行為改變的關(guān)鍵因素。其中，重要的炎癥因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1、6(IL-1、IL-6)等。TNF-α可激活T細(xì)胞，促進(jìn)其他炎癥因子的分泌，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。TNF-α和IL-1等可快速激活細(xì)胞核因子NF-κB通路，活化的NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與基因啟動(dòng)子區(qū)域的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥與免疫反應(yīng)［31－33］。而炎癥微環(huán)境對(duì)生物修復(fù)材料－細(xì)胞復(fù)合體成骨分化和硬組織再生影響的研究，則基本屬于空白。

3.1.3 化學(xué)微環(huán)境對(duì)硬組織修復(fù)材料與骨骼細(xì)胞功能的作用

低氧環(huán)境對(duì)多種類型細(xì)胞的分化和基因表達(dá)產(chǎn)生影響，而骨折后血腫區(qū)域由于供血不足會(huì)在區(qū)域內(nèi)造成低氧，并促進(jìn)釋放大量細(xì)胞因子。這種低氧環(huán)境對(duì)骨折區(qū)域骨再生可能存在影響。Brusselmans K等的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，低氧可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells，ES)表達(dá)VEGF，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活，而抑制VEGF基因的表達(dá)，則在48 h的低氧培養(yǎng)中，ES細(xì)胞凋亡增加了10倍［34］。同時(shí)低氧環(huán)境會(huì)促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)HIF-1，繼而誘導(dǎo)缺血組織大量表達(dá)SDF-1，從而促進(jìn)血液循環(huán)中的干細(xì)胞向缺血處歸巢，進(jìn)而促進(jìn)血管形成。比如Yamaguchi J等利用小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在缺血組織中SDF-1能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)的歸巢［34］。另外，有學(xué)者利用Akt基因修飾的MSCs植入缺血組織，發(fā)現(xiàn)MSCs的存活率也明顯較高，但是，VEGF通過怎樣的機(jī)制促進(jìn)干細(xì)胞耐受低氧，以及與相關(guān)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系尚不清楚［35］。HIF-1ɑ通路調(diào)控的下游基因多達(dá)到100個(gè)，除主要通過VEGF調(diào)控血管生成外，也參與多種細(xì)胞的存活、增殖、遷移和能量代謝等重要過程。但低氧環(huán)境對(duì)MSCs向成骨分化的影響，目前沒有確切的結(jié)論。

以高分子聚合物作為硬組織修復(fù)材料的降解過程，可引起宿主微環(huán)境pH值的變化。如聚乳酸－羥基乙酸共聚物(Poly Lactic-co-Glycolic Acid，PLGA)在體內(nèi)降解后，使局部微環(huán)境酸性增加，會(huì)引發(fā)細(xì)胞分泌促炎癥因子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER Stress)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。在這個(gè)過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白 BI-1(BAX Inhibitor-1，BI-1)和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路起了關(guān)鍵的作用。BI-1是一種pH值依賴的鈣通道蛋白，可在酸性環(huán)境下促進(jìn)Ca2+釋放，促炎癥因子積聚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而激活MAPK信號(hào)通路，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)磷酸化JNK水平激增，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［36］。

3.2 硬組織修復(fù)材料在骨再生過程中的轉(zhuǎn)歸行為

硬組織修復(fù)材料在組織再生過程中的轉(zhuǎn)歸行為，受宿主微環(huán)境、宿主細(xì)胞以及材料本身諸多因素的影響，其具體的轉(zhuǎn)歸機(jī)制尚不十分清楚。正常骨組織處于持續(xù)的力學(xué)作用下，模擬在體環(huán)境、且伴有模擬生理溶液(SBF)的流動(dòng)，來研究力學(xué)載荷對(duì)硬組織修復(fù)材料的轉(zhuǎn)歸行為是很重要的。Yang等［30］采用熱致相分離/粒子洗脫法，制備PLGA和 PLGA/磷酸三鈣(β-TCP)多孔支架，比較了動(dòng)態(tài)和靜態(tài)載荷條件下三維支架的降解行為。結(jié)果表明，循環(huán)壓載荷明顯加速了兩種三維支架的降解且復(fù)合成骨細(xì)胞的增殖受其影響。Kang等［37］的研究得出，動(dòng)態(tài)載荷促進(jìn)PLA/β-TCP三維支架的體外降解。Rolda等［38］將 BMP7/BCP陶瓷支架材料復(fù)合 MSCs植入小鼠體內(nèi)12周后，發(fā)現(xiàn)材料被降解并有新骨形成，支架材料中未與新骨接觸部分的降解程度較高。Jiang等［39］發(fā)現(xiàn)殼聚糖-PLAGA熔結(jié)的三維支架，在體外較PLAGA降解慢;前者固定上肝素和BMP-2后植入兔體內(nèi)更能促進(jìn)新骨形成，后者也能以膜內(nèi)成骨方式形成新骨組織。上述研究揭示了一些生物活性材料或生物材料－細(xì)胞復(fù)合物在體內(nèi)外的轉(zhuǎn)歸行為，但遠(yuǎn)未闡明硬組織修復(fù)材料內(nèi)，新生組織形成與材料降解的關(guān)系以及降解產(chǎn)物在體內(nèi)的分布、聚集和代謝等過程。

盡管已有學(xué)者對(duì)聚苯乙烯乳膠納米微球，在體內(nèi)的分布、蓄積及代謝引起的機(jī)體反應(yīng)［40］與碳納米管激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答［41］進(jìn)行了研究，但納米生物活性材料在體內(nèi)是可降解的，機(jī)體對(duì)其的響應(yīng)可能與其在體內(nèi)的降解速度及Ca，P離子在細(xì)胞、組織的蓄積濃度有關(guān)。目前對(duì)生物活性材料的納米粒子在細(xì)胞、組織、器官的轉(zhuǎn)歸及機(jī)體應(yīng)答，還缺乏全面科學(xué)的認(rèn)識(shí)。因此，有必要深入開展該領(lǐng)域的研究工作，闡明納米生物活性材料與機(jī)體的相互作用機(jī)理，對(duì)指導(dǎo)納米生物活性材料的設(shè)計(jì)、組裝開發(fā)出新型硬組織修復(fù)材料有重要的意義。

生物陶瓷降解溶出的Ca，P離子的一部分，可為局部新生骨組織利用，其他通過組織液、血液帶到全身。硬組織修復(fù)材料摻雜的一些微量金屬元素的溶出，可直接參與細(xì)胞代謝、分裂、生長等生理過程。生物活性玻璃中含有的微量Si，是有機(jī)體內(nèi)必需的微量元素，生物玻璃降解過程中釋放的Si，對(duì)成骨是有益的。例如，Si的補(bǔ)充顯著增加了去勢(shì)大鼠股骨和脛骨的骨密度［42］，Si和Ca對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松具有交互作用，在Ca攝入不足時(shí)，Si的補(bǔ)充能增加脊柱、股骨和脛骨的骨密度［43］。在骨骼生長發(fā)育過程中，Zn缺乏可引起骨的生長遲緩，甚至骨骼畸形。適量的Zn可促進(jìn)骨生長及鈣化，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Zn能抑制破骨細(xì)胞的形成，從而抑制骨吸收［44－45］。

另一方面，脂肪族聚酯作為生物醫(yī)用高分子材料，在臨床應(yīng)用已有30年的歷史，大部分研究集中在體外環(huán)境中模擬高分子材料的降解行為［46］，對(duì)于體內(nèi)環(huán)境下降解行為及機(jī)理的研究較少?，F(xiàn)有的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，多集中在觀察材料結(jié)構(gòu)及外觀形貌變化、質(zhì)量損失及一定時(shí)期內(nèi)降解產(chǎn)物對(duì)于周圍組織的影響上［47］。目前最大的問題，就是對(duì)于高分子材料在體內(nèi)降解過程中炎癥與免疫反應(yīng)的序列事件和機(jī)理尚不明確;而對(duì)于不同降解階段降解產(chǎn)物的分子量大小及分布，在不同組織器官內(nèi)的分布規(guī)律，有無蓄積傷害及代謝途徑都沒有系統(tǒng)的研究。如何針對(duì)不同的植入環(huán)境，篩選出影響降解行為變化的關(guān)鍵因素，最終在設(shè)計(jì)層面達(dá)到優(yōu)化，是制備降解行為與組織再生過程相匹配的硬組織修復(fù)材料一個(gè)亟待解決的問題。

綜上所述，宿主微環(huán)境中物理、化學(xué)、生物學(xué)因素對(duì)硬組織修復(fù)材料的降解和轉(zhuǎn)歸影響巨大。因此，建立能模擬宿主微環(huán)境的體外研究平臺(tái)，篩選出影響硬組織修復(fù)材料轉(zhuǎn)歸行為的材料學(xué)、宿主微環(huán)境和生物學(xué)關(guān)鍵因素，最終在設(shè)計(jì)層面達(dá)到優(yōu)化，制備出降解行為與組織再生過程相匹配的新型硬組織修復(fù)材料，將為新型硬組織修復(fù)材料的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供科學(xué)依據(jù)。

4 新型硬組織修復(fù)材料的功能化設(shè)計(jì)及其生物學(xué)效應(yīng)

硬組織修復(fù)材料在臨床上應(yīng)用較為廣泛的生物活性材料，包括羥基磷灰石(HAP)、磷酸三鈣(TCP)、生物活性玻璃等［48］。這些材料與傳統(tǒng)的生物惰性材料在化學(xué)成分上有顯著差異，在骨再生能力上有了質(zhì)的突躍。生物活性玻璃作為生物活性材料中的重要種類，由于其特有的無機(jī)非晶態(tài)化學(xué)結(jié)構(gòu)、基因激活特性及促進(jìn)生物礦化等優(yōu)異性能，被認(rèn)為是一類具有比其它結(jié)晶態(tài)生物活性材料更為優(yōu)越的硬組織修復(fù)材料，近年來越來越多地受到國際生物材料學(xué)界的關(guān)注。體外實(shí)驗(yàn)表明，溶膠－凝膠生物玻璃在模擬生理溶液(SBF)中釋放出可溶性Si及Ca離子的速度及形成低結(jié)晶度的HCA的速度，均高于熔融法生物玻璃［49］，顯示溶膠－凝膠生物活性玻璃，在調(diào)控成骨細(xì)胞增殖、分化上具有良好的應(yīng)用前景。

長期以來，國內(nèi)外對(duì)材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)、微－納米結(jié)構(gòu)、表面拓?fù)湫蚊驳葘?duì)細(xì)胞的遷移、粘附、增殖和分化的影響方式與規(guī)律進(jìn)行了大量的研究。這些材料的結(jié)構(gòu)性能，可通過多種途徑激活細(xì)胞相關(guān)受體、基因表達(dá)以及信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)等，來調(diào)控細(xì)胞學(xué)行為，如生物活性化學(xué)基團(tuán)直接與細(xì)胞膜表面受體相互作用，通過介導(dǎo)材料表面吸附蛋白調(diào)控細(xì)胞行為，以及通過溶出成分或降解產(chǎn)物來調(diào)控細(xì)胞行為［50－53］。而功能性小分子對(duì)細(xì)胞特異功能的調(diào)控提供了另一種可供選擇的途徑［54－56］，同時(shí)，也為材料結(jié)構(gòu)的功能化設(shè)計(jì)提供了可行性。目前已發(fā)現(xiàn)一些具有抗炎、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和血管生成能力的天然功能小分子，如Ginkolide B可通過激活內(nèi)皮祖細(xì)胞Akt及MAPK/p38通路，提高其粘附、遷移和增殖以及體外成血管分化能力［56］。Icariin能促進(jìn)MSCs成骨分化，上調(diào)成骨相關(guān)基因 COL1a2、BMP-2、OSX和RUNX-2等的表達(dá)，能促使成骨細(xì)胞成熟、礦化，抑制破骨細(xì)胞，減慢骨吸收過程［57－59］。Quercetin，Curcumin，Ursolic acid等小分子表現(xiàn)出抗炎特性，也為未來在修復(fù)材料結(jié)構(gòu)上設(shè)計(jì)抗炎功能提供了多種可供選擇的分子［60］。點(diǎn)擊化學(xué)是最近10年來出現(xiàn)的重要現(xiàn)代化學(xué)合成方法，提供了將上述小分子修飾到材料結(jié)構(gòu)單元上的良好途徑，通過簡(jiǎn)單高效的反應(yīng)，來實(shí)現(xiàn)具有新型功能的分子結(jié)構(gòu)，受到了有機(jī)化學(xué)、藥物化學(xué)、生物大分子化學(xué)以及功能高分子材料化學(xué)研究人員的高度重視［61］。通過點(diǎn)擊化學(xué)在可降解有機(jī)高分子側(cè)基上便利地引入活性功能小分子，結(jié)合對(duì)可降解高分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，能夠?qū)崿F(xiàn)在高分子結(jié)構(gòu)預(yù)設(shè)的可降解性能、彈性模量及生物學(xué)功能性能。

目前，納米結(jié)構(gòu)與納米尺度對(duì)細(xì)胞粘附、遷移、增殖及分化的影響，同樣也引起了研究人員的廣泛興趣。許多研究者報(bào)道了不同微納米形態(tài)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)硬組織修復(fù)材料生物活性的分子機(jī)制［62－63］，但納米材料的生物毒性需重點(diǎn)關(guān)注。研究表明，納米金顆粒能夠通過吸附血漿中的某些蛋白，激活細(xì)胞的p38 MAPK途徑，在啟動(dòng)成骨分化的同時(shí)，抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化［64］。在可降解聚羥基烷酸酯中添加45S5生物玻璃成分，提高了復(fù)合材料表面的生物活性，有利于形成類骨羥基磷灰石的沉積，同時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖、堿性磷酸酶活性及骨鈣素分泌［65］。在生物玻璃陶瓷(Bioverit II)上制備出具有納米結(jié)構(gòu)的硅表面涂層，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示增強(qiáng)了成骨效應(yīng)，同時(shí)抑制了炎癥細(xì)胞在材料表面的粘附［66］。上述研究讓人們看到了納米結(jié)構(gòu)與納米材料正向作用的應(yīng)用前景，進(jìn)一步深入研究其調(diào)控細(xì)胞行為的途徑與分子機(jī)理研究，對(duì)如何設(shè)計(jì)新一代具有高生物安全性，同時(shí)具有特定生物學(xué)功能的硬組織修復(fù)材料，具有重要的指導(dǎo)意義。

隨著多種微加工新方法的出現(xiàn)，對(duì)材料相關(guān)表面拓?fù)湮锢?、化學(xué)圖案及其尺寸的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究報(bào)道逐年增多。表面形態(tài)結(jié)構(gòu)如材料表面的粗糙度、不同的表層微觀形貌結(jié)構(gòu)如凹槽型、山脊型、孔洞型、孔洞的大小及分布等，都對(duì)細(xì)胞形態(tài)、粘附、鋪展、遷移、定向生長有很重要的影響［63，67－68］。近年來發(fā)展起來的二維細(xì)胞圖案化技術(shù)［69］，為藥物分子檢測(cè)及研究材料表面界面生物活性分子調(diào)控細(xì)胞學(xué)行為的機(jī)制和特性［70－71］提供了重要的工具。例如，將圖案化的金膜共價(jià)接枝到PEG水凝膠表面，用以固定MSCs從而形成材料表面干細(xì)胞的圖案化結(jié)構(gòu)。通過改變干細(xì)胞圖案的形狀和大小，可改變與干細(xì)胞之間相互作用從而影響干細(xì)胞分化［72］。采用電化學(xué)方法在鍍有金膜的表面吸附硫醇單分子層，將細(xì)胞流經(jīng)圖案化的聚合物微通道，實(shí)現(xiàn)了在金膜表面指定區(qū)域的固定［73］。

隨著納米合成及控制技術(shù)，相關(guān)微加工、微刻蝕等新技術(shù)的不斷發(fā)展，利用微納結(jié)構(gòu)與形態(tài)調(diào)控細(xì)胞行為，將超越化學(xué)成分與結(jié)構(gòu)調(diào)控的局限性，大大拓展可用的方法與手段。美國康奈爾大學(xué)的March等利用生物微加工技術(shù)，制備出三維絨毛狀的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和膠原，作為人工腸絨毛，研究上皮直腸癌細(xì)胞在材料表面的粘附、鋪展、增殖和分化，以及癌細(xì)胞對(duì)材料釋放藥物的響應(yīng)［74］。麻省理工學(xué)院的Langer教授課題組，將聚癸二酸丙三醇酯加工成三維圖案化的薄層后，通過熱壓方式層層疊加構(gòu)建了具有特定通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的生物活性材料，并研究了肝細(xì)胞在其中的細(xì)胞學(xué)行為［75］。利用微結(jié)構(gòu)調(diào)控細(xì)胞學(xué)行為，已經(jīng)成為生物材料研究人員進(jìn)行材料結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)必須認(rèn)真考慮的環(huán)節(jié)。

在宏觀結(jié)構(gòu)的大尺度上，硬組織修復(fù)材料的內(nèi)部孔徑結(jié)構(gòu)、孔隙率、孔的聯(lián)通特性，多級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)效應(yīng)，將能夠更好地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的遷移與組織的修復(fù)，不僅對(duì)修復(fù)過程中營養(yǎng)成分的輸運(yùn)、代謝產(chǎn)物及降解產(chǎn)物的排除、細(xì)胞向材料內(nèi)部的遷移通道、血管在材料內(nèi)部的分布方式、細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞學(xué)行為等均有直接的影響，對(duì)成骨細(xì)胞的分化調(diào)控都會(huì)產(chǎn)生直接的效應(yīng)。而新型成形制備技術(shù)如微區(qū)圖案技術(shù)、顯微刻蝕技術(shù)、三維打印技術(shù)、電仿絲技術(shù)、快速成形技術(shù)、梯度材料結(jié)構(gòu)控制技術(shù)、一體化構(gòu)建技術(shù)等，將成為未來組織修復(fù)材料的主要成形加工技術(shù)，綜合應(yīng)用多種先進(jìn)制造技術(shù)手段，使得實(shí)現(xiàn)具有復(fù)雜空間可控結(jié)構(gòu)的實(shí)現(xiàn)更為容易，最終形成預(yù)設(shè)形狀、結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度、表面與空間分布的化學(xué)及生物學(xué)環(huán)境的硬組織修復(fù)材料［19，72，74－75］。

綜上所述，未來圍繞人體硬組織缺損修復(fù)所涉及的關(guān)鍵科學(xué)問題，開展材料學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程、生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等多學(xué)科交叉、協(xié)同研究，從以下4個(gè)層面來設(shè)計(jì)和構(gòu)建結(jié)構(gòu)－功能可調(diào)控的新型硬組織修復(fù)材料:①分子結(jié)構(gòu)層面。主要決定材料的基本性質(zhì)，包括生物活性、生物相容性、可降解性和材料具有的特殊功能(如成骨、成血管、抗炎、抗免疫等);②納米結(jié)構(gòu)層面。調(diào)節(jié)與其相接觸細(xì)胞的粘附、鋪展與基因表達(dá)過程;③微米結(jié)構(gòu)層面。決定材料及其周圍孔隙的形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小和微觀界面性質(zhì)，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞在界面的特異性吸附，細(xì)胞的遷移與定向生長;④宏觀大尺度層面。決定修復(fù)組織總的形狀和大小以及材料的整體性能。從材料組成、微納結(jié)構(gòu)和宏觀性能上，對(duì)不同層次結(jié)構(gòu)與細(xì)胞相互作用的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行深入研究，尋找能夠促進(jìn)成骨、成血管、協(xié)調(diào)體內(nèi)炎癥及免疫的良好微觀及宏觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而指導(dǎo)新型硬組織修復(fù)材料的設(shè)計(jì)和制備，將可提升我國在該領(lǐng)域的自主創(chuàng)新能力，促進(jìn)具有我國特色和自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的第3代生物醫(yī)學(xué)材料和產(chǎn)品開發(fā)。

5 結(jié)語

硬組織修復(fù)材料植入體內(nèi)后所引發(fā)宿主的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、組織再生修復(fù)的序列事件并不完全清楚，另一方面，宿主微環(huán)境(力學(xué)微環(huán)境、化學(xué)微環(huán)境、炎癥微環(huán)境)對(duì)植入材料與宿主組織細(xì)胞的相互作用及植入材料在骨再生過程中的轉(zhuǎn)歸行為等諸多復(fù)雜問題尚未完全明了。因此，進(jìn)一步開展硬組織修復(fù)材料的骨再生機(jī)理研究，深入探討硬組織修復(fù)材料與宿主防御和骨再生體系的關(guān)系，以及宿主微環(huán)境對(duì)植入材料與宿主組織細(xì)胞的相互作用及材料轉(zhuǎn)歸行為的規(guī)律，探索硬組織修復(fù)材料在體內(nèi)轉(zhuǎn)歸過程中，組織適配、力學(xué)適配和降解適配機(jī)制，揭示硬組織修復(fù)材料植入體后所發(fā)生的序列事件，受材料本身和宿主微環(huán)境等多因素影響的表觀遺傳學(xué)機(jī)制與信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的分子機(jī)理，進(jìn)而指導(dǎo)在材料的分子組成、微－納結(jié)構(gòu)和宏觀性能設(shè)計(jì)層面上優(yōu)化、制備出具有“主動(dòng)修復(fù)功能”和“可調(diào)控生物響應(yīng)特性”的新型硬組織修復(fù)材料，從而加速我國新型硬組織修復(fù)材料與產(chǎn)品的設(shè)計(jì)、開發(fā)和應(yīng)用。

References

［1］Hench L L，Wilson J.Surface-Active Biomaterials［J］.Science，1984，226(4 675):630－636.

［2］Hench L L，Polak J M.Third-Generation Biomedical Materials［J］.Science，2002，295(5 557):1 014 －1 017.

［3］Foldager C.ISSLS Prize Winner:Positron Emission Tomography and Magnetic Resonance Imaging for Monitoring Interbody Fusion with Equine Bone Protein Extract，Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2，and Autograft［J］.Spine(Phila Pa1976)，2008，33(25):2 683－2 690.

［4］Foldager C.Differences in Early Osteogenesis and Bone Micro-Architecture in Anterior Lumbar Interbody Fusion with rhBMP-2，Equine Bone Protein Extract，and Autograft［J］.Bone，2009，45(2):267－273.

［5］Zou X.Different Mechanisms of Spinal Fusion Using Equine Bone Protein Extract，rhBMP-2 and Autograft During the Process of Anterior Lumbar Interbody Fusion［J］.Biomaterials，2009，30(6):991－1 004.

［6］Luan Y.The Retinoblastoma Protein is an Essential Mediator of Osteogenesis That Links the p204 Protein to the Cbfa1 Transcription Factor Thereby Increasing Its Activity［J］.J Biol Chem，2007，282(23):16 860－16 870.

［7］Gutierrez G M，Kong E，Hinds P W.Master or Slave:the Complex Relationship of RBP2 and pRb［J］.Cancer Cell，2005，7(6):501－502.

［8］Benevolenskaya E V.Binding of pRB to the PHD Protein RBP2 Promotes Cellular Differentiation［J］.Mol Cell，2005，18(6):623－635.

［9］Ge W.Inhibition of Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells by Retinoblastoma Binding Protein 2 Repression of RUNX2-Activated Transcription［J］.Stem Cells，2011，29(7):1 112－1 125.

［10］Levenberg S.Differentiation of Human Embryonic Stem Cells on Three-Dimensional Polymer Scaffolds［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(22):12 741－12 746.

［11］Levenberg S，Langer R.Advances in Tissue Engineering［J］.Curr Top Dev Biol，2004，61:113 －134.

［12］Hersel U，Dahmen C，Kessler H.RGD Modified Polymers:Biomaterials for Stimulated Cell Adhesion and Beyond［J］.Biomaterials，2003，24(24):4 385 －4 415.

［13］Zhang H，Lin C Y，Hollister S J.The Interaction between Bone Marrow Stromal Cells and RGD-Modified Three-Dimensional Porous Polycaprolactone Scaffolds［J］.Biomaterials，2009，30(25):4 063－4 069.

［14］Lu Z.Bone Biomimetic Microenvironment Induces Osteogenic Differentiation of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells［J］.Nanomedicine:Nanotechnology，Biology and Medicine，2011.(in Press)DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.nano.2011.07.012

［15］Chen M.Self-Assembled Composite Matrix in a Hierarchical 3-D Scaffold for Bone Tissue Engineering［J］.Acta Biomater，2011，7(5):2 244－2 255.

［16］Mygind T.Mesenchymal Stem Cell Ingrowth and Differentiation on Coralline Hydroxyapatite Scaffolds［J］.Biomaterials，2007，28(6):1 036－1 047.

［17］Appleford M R.The Effects of Trabecular Calcium Phosphate Scaffolds on Stress Signaling in Osteoblast Precursor Cells［J］.Biomaterials，2007，28(17):2 747－2 753.

［18］Olivares-Navarrete R.Mediation of Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells on Titanium Surfaces by a Wnt-Integrin Feedback Loop［J］.Biomaterials，2011，32(27):6 399－6 411.

［19］Olivares-Navarrete R.The Roles of Wnt Signaling Modulators Dickkopf-1(Dkk1)and Dickkopf-2(Dkk2)and Cell Maturation State in Osteogenesis on Microstructured Titanium Surfaces［J］.Biomaterials，2010，31(8):2 015 －2 024.

［20］Zhang C.Inhibition of Wnt Signaling by the Osteoblast-Specific Transcription Factor Osterix［J］.Proc Natl Acad SciUSA，2008，105(19):6 936－6 941.

［21］Soltanoff C S.Signaling Networks that Control the Lineage Commitment and Differentiation of Bone Cells［J］.Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2009，19(1):1－46.

［22］Javed A，Chen H，Ghori F Y.Genetic and Transcriptional Control of Bone Formation［J］.Oral Maxillofac Surg Clin North Am，2010，22(3):283－293.

［23］Zhang C.Transcriptional Regulation of Bone Formation by the Osteoblast-Specific Transcription Factor Osx［J］.J Orthop Surg Res，2010(5):35 －37.

［24］St-Jacques B，Hammerschmidt M，McMahon A P.Indian Hedgehog Signaling Regulates Proliferation and Differentiation of Chondrocytes and Its Essential for Bone Formation［J］.Genes Dev，1999，13(16):2 072－2 086.

［25］Komori T.Targeted Disruption of Cbfa1 Results in a Complete Lack of Bone Fformation Owing to Maturational Arrest of Osteoblasts［J］.Cell，1997，89(5):755 － 764.

［26］Nakashima K.The Novel Zinc Finger-Containing Transcription Factor Osterix is Required for Osteoblast Differentiation and Bone Formation［J］.Cell，2002，108(1):17 － 29.

［27］Rath B.Compressive Forces Induce Osteogenic Gene Expression in Calvarial Osteoblasts［J］.J Biomech，2008，41(5):1 095－1 103.

［28］Sittichockechaiwut A.Use of Rapidly Mineralising Osteoblasts and Short Periods of Mechanical Loading to Accelerate Matrix Maturation in 3D Scaffolds［J］.Bone，2009，44(5):822－829.

［29］Dumas V.Effect of Dual Frequency Cyclic Compression on Matrix Deposition by Osteoblast-Like Cells Grown in 3D Scaffolds and on Modulation of VEGF Variant Expression［J］.Biomaterials，2009，30(19):3 279－3 288.

［30］Yang Y.Effect of Cyclic Loading on the in Vitro Degradation of Poly(L-Lactide-Co-Glycolide)Scaffolds［J］.J Biomater Sci Polym Ed，2010，21(1):53－66.

［31］Granet C，Miossec P.Combination of the Pro-Inflammatory Cytokines IL-1，TNF-Alpha and IL-17 Leads to Enhanced Expression and Additional Recruitment of AP-1 Family Members，Egr-1 and NF-KappaB in Osteoblast-Like Cells［J］.Cytokine，2004，26(4):169－177.

［32］Rhodus N L.A Comparison of Pro-Inflammatory，NF-KappaBDependent Cytokines:TNF-Alpha，IL-1-Alpha，IL-6，and IL-8 in Different Oral Fluids From Oral Lichen Planus Patients［J］.Clin Immunol，2005，114(3):278 －283.

［33］Royuela M.TNF-Alpha/IL-1/NF-KappaB Transduction Pathway in Human Cancer Prostate［J］.Histol Histopathol，2008，23(10):1 279－1 290.

［34］Yamaguchi J.Stromal Cell-Derived Factor-1 Effects on Expanded Endothelial Progenitor Cell Recruitment for Ischemic Neovascularization［J］.Circulation，2003，107(9):1 322 －1 328.

［35］Abdollahi H.The Role of Hypoxia in Stem Cell Differentiation and Therapeutics［J］.J Surg Res，2011，165(1):112 － 117.

［36］Kim H R.Bax Inhibitor-1 is a pH-Dependent Regulator of Ca2+Channel Activity in the Endoplasmic Reticulum［J］.J Biol Chem，2008，283(23):15 946－15 955.

［37］Kang Y.A Study on the in Vitro Degradation Properties of Poly(L-Lactic Acid)/Beta-Tricalcuim Phosphate(PLLA/beta-TCP)Scaffold Under Dynamic Loading［J］.Med Eng Phys，2009，31(5):589－594.

［38］Roldan J C.Bone Formation and Degradation of a Highly Porous Biphasic Calcium Phosphate Ceramic in Presence of BMP-7，VEGF and Mesenchymal Stem Cells in an Ectopic Mouse Model［J］.J Craniomaxillofac Surg，2010，38(6):423－430.

［39］Jiang T.Chitosan-Poly(lactide-Co-Glycolide)Microsphere-Based Scaffolds for Bone Tissue Engineering:in Vitro Degradation and in Vivo Bone Regeneration Studies［J］.Acta Biomater，2010，6(9):3 457－3 470.

［40］Sarlo K.Tissue Distribution of 20 nm，100 nm and 1 000 nm Fluorescent Polystyrene Latex Nanospheres Following Acute Systemic or Acute and Repeat Airway Exposure in Rat［J］.Toxicology，2009，263(2/3):117－126.

［41］Meng J.Subcutaneous Injection of Water-Soluble Multi-Walled Carbon Nanotubes in Tumor-Bearing Mice Boosts Host Immune Activity［J］.Nanotechnology，2010，21(14):145 104.

［42］Bae Y J.Short-Term Administration of Water-Soluble Silicon Improves Mineral Density of the Femur and Tibia in Ovariectomized Rats［J］.Biol Trace Elem Res，2008，124(2):157 － 163.

［43］Kim M H.Silicon Supplementation Improves the Bone Mineral Density of Calcium-Deficient Ovariectomized Rats by Reducing Bone Resorption［J］.Biol Trace Elem Res，2009，128(3):239－247.

［44］Kishi S，Yamaguchi M.Inhibitory Effect of Zinc Compounds on Osteoclast-Like Cell Formation in Mouse Marrow Cultures［J］.Biochem Pharmacol，1994，48(6):1 225 －1 230.

［45］Moonga B S，Dempster D W.Zinc is a Potent Inhibitor of Osteoclastic Bone Resorption in Vitro［J］.J Bone Miner Res，1995，10(3):453－457.

［46］Hofmann D.Knowledge-Based Approach Towards Hydrolytic Degradation of Polymer-Based Biomaterials［J］.Adv Mater，2009，21(32/33):3 237－3 245.

［47］Schlichting K，Dahne M，Weiler A.Biodegradable Composite Implants［J］.Sports Med Arthrosc，2006，14(3):169 － 176.

［48］Hench L.Bioceramics:from Concept to Clinic［J］.Journal of the American Ceramic Society，1991，74(7):1 487－1 510.

［49］Chen X，Meng Y，Li Y，etal.Investigation on Bio-Mineralization of Melt and Sol-Gel Derived Bioactive Glasses［J］.Applied Surface Science，2008，255(2):562－564.

［50］Xynos I D，Edgar A J，Buttery L D，etal.Gene-Expression Profiling of Human Osteoblasts Following Treatment with the Ionic Products of Bioglass 45S5 Dissolution［J］.J Biomed Mater Res，2001，55(2):151－157.

［51］Jell G，Stevens M M.Gene Activation by Bioactive Glasses［J］.J Mater Sci Mater Med，2006，17(11):997－1 002.

［52］Leucht P，Kim J B，Helms J A.Beta-Catenin-Dependent Wnt Signaling in Mandibular Bone Regeneration［J］.J Bone Joint Surg Am，2008，90(Suppl 1):3－8.

［53］Chen Y，Alman B A.Wnt Pathway，an Essential Role in Bone Regeneration［J］.J Cell Biochem，2009，106(3):353－362.

［54］Ding S，Wu T Y H，Brinker A，etal.Synthetic Small Molecules That Control Stem Cell Fate［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100(13):7 632.

［55］Chen S，Do J T，Zhang Q，etal.Self-Renewal of Embryonic Stem Cells by a Small Molecule［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2006，103(46):17 266－17 271.

［56］Tang Y，Huang B，Sun L，etal.Ginkgolide B Promotes Proliferation and Functional Activities of Bone Marrow-Derived Endothelial Progenitor Cell Involvement of Akt-eNOS and MAPK-p38 Signaling Pathways［J］.European Cells and Materials，2011，21:459－469.

［57］Chen K M，Ge B F，Ma H P，etal.Icariin，a Flavonoid from the Herb Epimedium Enhances the Osteogenic Differentiation of Rat Primary Bone Marrow Stromal Cells［J］.Journal of Pharmaceutical Sciences，2005，60(12):939－942.

［58］Ma H P，Ming L G，Ge B F，etal.Icariin is More Potent Than Genistein in Promoting Osteoblast Differentiation and Mineralization in Vitro［J］.Journal of Cellular Biochemistry，2011，112(3):916－923.

［59］Chen K M，Ge B F，Liu X Y，etal.Icariin Inhibits the Osteoclast Formation Induced by RANKL and Macrophage-Colony Stimulating Factor in Mouse Bone Marrow Culture［J］.Pharmazie，2007，62(5):388－391.

［60］Venkatesha S H，Berman B M，Moudgil K D.Herbal Medicinal Products Target Defined Biochemical and Molecular Mediators of Inflammatory Autoimmune Arthritis［J］.Bioorganic＆Medicinal Chemistry，2011，19(1):21－29.

［61］Binder W H，Sachsenhofer R.‘Click’Chemistry in Polymer and Material Science:an Update［J］.Macromolecular Rapid Communications，2008，29(12/13):952－981.

［62］Curtis A，Wilkinson C.Nanotechniques and Approaches in Biotechnology［J］.Materials Today，2001，4(3):22 －28.

［63］Stevens M M，George J H.Exploring and Engineering the Cell Surface Interface［J］.Science，2005，310(5 751):1 135－1 138.

［64］Yi C，Liu D，F(xiàn)ong C C，etal.Gold Nanoparticles Promote Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Through p38 MAPK Pathway［J］.ACS Nano，2010，4(11):6 339－6 348.

［65］Misra S K，Ansari T，Mohn D，etal.Effect of Nanoparticulate Bioactive Glass Particles on Bioactivity and Cytocompatibility of Poly(3-Hydroxybutyrate)Composites［J］.Journal of The Royal Society Interface，2010，7(44):453－465.

［66］Vogt J C，Brandes G，Ehlert N，etal.Free Bioverit(R)II Implants Coated with a Nanoporous Silica Layer in a Mouse Ear Model—A Histological Study［J］.Journal of Biomaterials Applications，2009，24(2):175－191.

［67］Anselme K，Bigerelle M.Topography Effects of Pure Titanium Substrates on Human Osteoblast Long-Term Adhesion［J］.Acta Biomaterialia，2005，1(2):211－222.

［68］Dalby M J，Andar A，Nag A，etal.Genomic Expression of Mesenchymal Stem Cells to Altered Nanoscale Topographies［J］.Journal of the Royal Society Interface，2008，5(26):1 055 －1 065.

［69］McAlear J H.Microdevice Substrate and Method for Making Micropattern Devices:US，4103064［P］.1978－07－25.

［70］Théry M，Bornens M.Cell Shape and Cell Division［J］.Current Opinion in Cell Biology，2006，18(6):648 －657.

［71］Chen C S，Mrksich M，Huang S，etal.Geometric Control of Cell Life and Death［J］.Science，1997，276(5 317):1 425－1 428.

［72］Tang J，Peng R，Ding J.The Regulation of Stem Cell Differentiation by Cell-Cell Contact on Micropatterned Material Surfaces［J］.Biomaterials，2010，31(9):2 470－2 476.

［73］Li Y，Yuan B，Ji H，etal.A Method for Patterning Multiple Types of Cells by Using Electrochemical Desorption of Self-Assembled Monolayers within Microfluidic Channels［J］.Angewandte Chemie，2007.46:1 194 －1 196.

［74］Sung J H，Yu J，Luo D，etal.Microscale 3-D Hydrogel Scaffold for Biomimetic Gastrointestinal(GI)Tract Model［J］.Lab Chip，2010，11:389－392.

［75］Bettinger C J，Weinberg E J，Kulig K M，etal.Three-Dimensional Microfluidic Tissue-Engineering Scaffolds Using a Flexible Biodegradable Polymer［J］.Advanced Materials，2006，18(2):165－169.

Bone Regeneration Mechanism of Advanced Biomaterials for Hard Tissue Repair

ZOU Xuenong1，CHEN Dafu2，TIAN Wei2，ZHANG Xizheng3，WU Gang4，DONG Hua4，ZHOU Yongsheng5，ZHOU Guangqian6
(1.Orthopaedic Research Institute，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China)
(2.Beijing Traumatological Orthopaedic Research Institute，Beijing Jishutan Hospital，Beijing 100035，China)
(3.Research Institute for Medical Equipment，Military Medical Science Academy of the PLA，Tianjin 300161，China)
(4.National Engineering Research Center for Human Tissue Restoration and Resconstruction，South China university of technology，Guangzhou 510006，China)
(5.Beijing University Hospital of Stomatology，Beijing 100081，China)
(6.Medical school of Shenzhen University，Shenzhen 518060，China)

Traditional biomaterials for hard tissue repair in composition and structure are hugely different with human bone tissue.The repairing process of these materials is basically a passive“filling”process when implanted in the body.Because new bone formation and material degradation rate do not match well enough，it is difficult to achieve the real“biological fusion”，and this restricted the use of materials in orthopaedic clinical application.Therefore，design and preparation of advanced third generation biomaterials for hard tissue repair with“active repair function”and“controlled biological response characteristics”has become the new demand of orthopaedic clinical application and future research direction.This paper introduced main research methods for bone regeneration mechanisms of advanced biomaterials for hard tissue repair，and it also summarized the current research results of interactions between these biomaterials and host cells in host microenvironment，and interactions between the biomaterials and host defense responses in the process of bone regeneration.These sequential events after the implantation of advanced biomaterials for hard tissue repair are apparently controlled by gene regulation，which is possible to be modified by a series of epigenetic mechanisms with many factors such as material itself and host microenvironmental factors.This paper puts forward new problemsexisted in theresearch of advanced biomaterials for hard tissue repair and development trend.

biomaterials for hard tissue repair;bone regeneration;host defense;host microenvironment;epigenetics;gene regulation

R318.08

A

1674－3962(2012)09－0040－10

2012－04－16

科技部973計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB619100);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30571892)

及通信作者:鄒學(xué)農(nóng)，男，1964年生，教授，博士生導(dǎo)師

10.7502/j.issn.1674－3962.2012.09.06