王德前，田 勇，李進(jìn)軍，沈軍達(dá)，陶爭榮，李國勤，盧立志

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

熱休克蛋白 (heat shock proteins，HSP)具有高度保守性［1］，廣泛存在于微生物、植物、動(dòng)物和人等生物機(jī)體內(nèi)。當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境脅迫或有害刺激后會(huì)誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)［2］。熱休克蛋白在應(yīng)激狀態(tài)下通過保護(hù)線粒體中呼吸鏈的完整性和抑制凋亡通路，提高細(xì)胞的耐受力，直接或間接地保護(hù)細(xì)胞，并幫助變性或不可溶的凝聚蛋白恢復(fù)天然構(gòu)象;另外熱休克蛋白還可作為分子伴侶和多肽鏈非特異性結(jié)合，催化介導(dǎo)蛋白質(zhì)特定構(gòu)象的形成，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)。HSP60除了具有 HSPs共同特征外，研究還表明正體結(jié)構(gòu)HSP60還可作為一個(gè)危險(xiǎn)預(yù)警信號(hào)作用于天然免疫系統(tǒng)，通過激活單核白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，并誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，參與免疫反應(yīng)［3-5］?？傊?，HSP60對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，改善細(xì)胞生存能力和減輕有害刺激損傷有著非常重要作用。

浙江省是蛋鴨飼養(yǎng)大省，年存欄2 000萬只以上，養(yǎng)殖規(guī)模與水平均居全國領(lǐng)先位置。蛋鴨舒適的飼養(yǎng)環(huán)境溫度一般為21～26℃;高于32℃高度應(yīng)激。浙江省夏季的氣候特征為長時(shí)間的高溫、高濕，全年32℃以上的高溫天數(shù)平均在35 d以上，在蛋鴨飼養(yǎng)密集的麗水、金華等地超過50 d。浙江省夏季氣候容易導(dǎo)致蛋鴨熱應(yīng)激綜合癥的發(fā)生，引起蛋鴨生理紊亂，降低采食量，造成生產(chǎn)性能、產(chǎn)品質(zhì)量下降，不利于蛋鴨生產(chǎn)。因此，研究HSP60對于誘導(dǎo)蛋鴨內(nèi)部的抗逆機(jī)制，增強(qiáng)其自身抵御環(huán)境突變能力，預(yù)防與控制熱應(yīng)激發(fā)生具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

畜禽HSP60方面研究很少，GenBank中收錄的序列僅有紅色原雞、火雞、珍珠雞、豬、馬、牛、狼、猴子、鱷魚共9種動(dòng)物［6-7］，蛋鴨HSP60研究還鮮見報(bào)道。為此，通過RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和RACE(末端快速擴(kuò)增)技術(shù)擴(kuò)增其蛋鴨HSP60基因編碼區(qū)，最后拼接而獲得全長核苷酸序列，并進(jìn)一步分析其推導(dǎo)的氨基酸序列，為深入研究Hsp60基因的熱應(yīng)激防控機(jī)理以及在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物材料、菌株與質(zhì)粒

試驗(yàn)蛋鴨肝臟樣品來自諸暨國偉禽業(yè)有限公司紹興鴨原種場，采樣后迅速液氮冷凍保存?zhèn)溆谩４竽c桿菌JM109菌株由該實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體pMD18-T購自大連寶生物公司。

1.1.2 酶與試劑

Taq聚 合 酶、TaKaRa EX Taq HS、dNTP、T4DNA連接酶、RT-PCR試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA Marker DL2000、Agarose Regular購自大連寶生物公司;GeneRacer試劑盒、總 RNA提取試劑盒 Trizol購自美國Invitrogen公司;氨芐青霉素、焦碳酸二乙酯(DEPC)購自北京天根公司;Tryptone、Yeast Extract購自O(shè)xioid公司。其他常規(guī)生化試劑為國產(chǎn)分析純。引物由上海生工公司合成，測序由Invitrogen公司 (上海)完成。

1.2 方法

1.2.1 蛋鴨肝臟總RNA提取

樣品用液氮研磨成粉末，稱取粉末約200 mg，采用Invitrogen公司 TRIZOL試劑盒提取總 RNA。用紫外分光光度計(jì)測定RNA含量 A260∶A280，并立即使用或于-80℃冰箱保存。提取的總RNA采用1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測。

1.2.2 蛋鴨HSP60中間片段的克隆

根據(jù)GenBank已經(jīng)報(bào)道的人、大鼠、小鼠HSP60 mRNA序列同源性比對分析結(jié)果，根據(jù)HSP60物種之間的氨基酸序列保守型設(shè)計(jì)簡并性引物 HSP60F1∶5＇ATHGARGGNATGAAGTTYGA3＇、HS P60R1∶5＇GCRTTYTTNGCDATNGTCA3＇、HSP60R2∶5＇C TTYTCRTTNACYTCNACRTC3＇。

第1輪PCR反應(yīng):引物HSP60F1、HSP60R1;反應(yīng) 體 系 為 25 μL:cDNA0.5 μL，HSP60F1(10 μmol·L-1)1.0 μL，HSP60R1(10 μmol·L-1)1.0 μL， Platinum PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen)22.5μL;反應(yīng)條件:94℃ 2 min;35 cycles∶94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、68 ℃ 1.5 min。

第2輪PCR反應(yīng):引物HSP60F1、HSP60R2;反應(yīng)體系為25μL:第1輪反應(yīng)產(chǎn)物，HSP60F1(10 μmol·L-1)1.0 μL，HSP60R2(10 μmol·L-1)1.0 μL， Platinum PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen)22.5μL;反應(yīng)條件同第1輪PCR反應(yīng)。

1.2.3 蛋鴨HSP60 5＇RACE片段的克隆

5＇RACE模板采用 GeneRacer Kit(Invitrogen)進(jìn)行合成，利用獲得的蛋鴨HSP60中間序列，設(shè)計(jì)5＇RACE引物序列。

第 1輪 PCR反應(yīng):引物 5＇GeneRacer inner primer、r HSP60-R1∶5＇GTTGTCACC AAAACCTGGCGCT TTGAC3＇;反應(yīng)體系為25μL:5＇RACE模板0.5μL，5＇GeneRacer outer primer(10 μmol· L-1)1.0 μL，rHSP60-R1(10 μmol· L-1)1.0 μL，Platinum PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen)22.5μL;Touchdown PCR 反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min，5 cycles∶94 ℃ 30 s、72℃ 1.5 min;5 cycles∶94℃ 30 s，70℃ 1.5 min;25cycles∶94 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、68 ℃ 1.5 min。

第2輪 PCR反應(yīng):引物 5＇GeneRacer inner primer、 r HSP60-R3 ∶ 5＇CCAAAGGCTTGCGGTG ACTATTGGCA3＇;反應(yīng)體系為25μL:第1輪 PCR產(chǎn)物0.5μL，其他同第1輪;反應(yīng)條件:94℃2 min，30 cycles∶94℃ 30 s、62℃ 30 s、68℃ 1.5 min。

1.2.4 蛋鴨HSP60 3＇RACE片段的克隆

3＇RACE模板采用 GeneRacer Kit(Invitrogen)進(jìn)行合成，利用獲得的鴨HSP60中間序列，設(shè)計(jì)3＇RACE引物序列。第 1輪 PCR反應(yīng)引物 3＇GeneRacer outer primer、r HSP60-F2∶5＇TCAGCCCC ATGACTTTGGTAAAGTTGG3＇，第2輪 PCR反應(yīng)引物 3＇GeneRacer outer primer、r HSP60-F3∶5＇CTGAT GGCGTAGCAGTATTAAA GGTTGG3＇;反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同5＇RACE。

1.2.5 TA克隆與序列分析

采用pMD18-T載體進(jìn)行TA克隆，將用膠回收試劑盒回收的 PCR產(chǎn)物，與 p MD18-T載體、T4DNA連接酶混合。10μL反應(yīng)體系的組成為:pMD18-T Vector DNA 1 μL，Insert DNA 4 μL ，Solution I 5μL。16℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞，在含 X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜直至長出白色菌落。得到的陽性克隆經(jīng)PCR驗(yàn)證后，將陽性菌穿刺培養(yǎng)后送上海英俊公司測序。DNA測序采用ABI公司的3730型全自動(dòng)DNA測序儀。對測序結(jié)果采用MegAlign軟件進(jìn)行cDNA序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋鴨肝臟總RNA提取

由圖1可知，提取的肝臟總RNA28S和18S的帶型較好，亮度比接近2∶1，A260/A280=2.04，說明RNA完整性很好，在提取過程中沒有降解，純度高，可以用于RT-PCR擴(kuò)增。

圖1 蛋鴨肝臟的總RNA

2.2 蛋鴨HSP60中間片段兼并引物擴(kuò)增

HSP60F1、HSP60R1作為第1輪反應(yīng)引物反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA后，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用兼并引物 HSP60F1、HSP60R2進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出1條約650 bp的條帶 (圖2)，經(jīng)TA克隆測序分析后發(fā)現(xiàn)，該片段正是目的基因片段。

圖2 蛋鴨HSP60的中間片段 (650 bp)

2.3 蛋鴨HSP60 5'RACE克隆分析

在獲得1段已知HSP60基因中間片段的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)第1輪反轉(zhuǎn)錄引物5 GeneRacer inner primer、r HSP60-R1、第2輪反轉(zhuǎn)錄引物 GeneRacer inner primer、r HSP60-R3，擴(kuò)增 HSP60基因片段 5＇端序列，得到1條約1 100 bp的目的基因片段 (圖3)。

圖3 蛋鴨HSP60的5＇RACE片段 (1 100 bp)

2.4 蛋鴨HSP60 3'RACE克隆分析

利用獲得的鴨HSP60中間序列，設(shè)計(jì)3＇RACE第 1輪反 轉(zhuǎn)錄引物 3＇GeneRacer outer primer、r HSP60-F2，第1輪反轉(zhuǎn)錄引物 3＇GeneRacer outer primer、r HSP60-F3;擴(kuò)增出了1條約1 100 bp的目標(biāo)基因條帶，經(jīng)TA克隆并測序驗(yàn)證后，上述片段為蛋鴨HSP60目標(biāo)基因片段 (圖4)。

圖4 蛋鴨HSP60的3＇RACE片段 (1 100 bp)

2.5 蛋鴨HSP60基因序列分析

MegAlign比對分析顯示，蛋鴨該基因與紅色原雞、火雞、珍珠雞等物種很高的序列同源性，相似系數(shù)分別為 93.1%，92.6%，90.9%(圖 5-6)，進(jìn)一步證明克隆的基因就是蛋鴨HSP60基因。5＇端片段和 3＇端片段拼接后，獲得 1條 2 027 bp HSP60基因mRNA序列，該序列3＇末端完整，距5＇端起始密碼子 ATG 58 bp，其中 ORF序列長度為 1 707 bp(圖 7-8)。

圖5 HSP60基因ORF核苷酸序列相似性分析

圖6 HSP60基因ORF序列進(jìn)化樹分析

3 小結(jié)與討論

通過GenBank中其他物種HSP60基因序列同源性比對，設(shè)計(jì)相應(yīng)的兼并引物，應(yīng)用RT-PCR手段成功克隆了1段約650 bp蛋鴨HSP60基因片段。在獲得已知序列的蛋鴨HSP60基因片段的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，采用RACE的技術(shù)手段，獲得了蛋鴨 HSP60基因 5＇、3＇端全長序列，長度都約為1 100 bp。序列拼接后獲得 1條 2 027 bp蛋鴨HSP60基因 mRNA序列，其中 ORF序列長度為1 707 bp。

蛋鴨HSP60基因ORF序列與紅色原雞、火雞、珍珠雞等家禽具有很高的同源性，相似系數(shù)都在90%以上;豬、牛、馬HSP60基因之間同源性也很高，均在94%以上;相近的物種具有更高的基因序列相似度，佐證了HSP60家族在進(jìn)化上具有高度保守性［8-9］。

圖7 蛋鴨HSP60基因ORF序列同源性比對分析 (1～900 bp)

圖8 蛋鴨HSP60基因ORF序列同源性比對分析 (901～1 720 bp)

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