劉宗林 許金山＊ 周澤揚(yáng) ，3

（1.重慶師范大學(xué) 重慶市動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400047；2.重慶師范大學(xué) 活性物質(zhì)生物技術(shù)教育部工程研究中心，重慶 400047；3.西南大學(xué) 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716）

微孢子蟲（Microsporidia）是一類專性寄生于細(xì)胞內(nèi)的單細(xì)胞真核生物，可以感染包括昆蟲、魚類和人類在內(nèi)的幾乎所有的動(dòng)物［1］。感染柞蠶的柞蠶微孢子蟲（Nosemaantheraeae），是柞蠶微粒子病的病原，其可經(jīng)母蛾傳染子代，給柞蠶養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失［2］。目前對(duì)柞蠶微粒子病的防治主要是通過胚種檢疫杜絕母體傳染和卵面與養(yǎng)蠶環(huán)境消毒。從分子水平探究柞蠶微孢子蟲對(duì)柞蠶的侵染機(jī)制，將有助于建立高效、準(zhǔn)確的病害檢疫和防治方法。ABYSS、Velvet，SOPAdenovo和Ray是目前常用的四種de novo組裝拼接軟件。Abyss［3］是基于Bruijn算法的拼接軟件，Abyss拼接的優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)行平行運(yùn)算，并且可以多線程以及多個(gè)庫(kù)同時(shí)運(yùn)行，它往往適用于大基因組的短paired－end reads。有研究者曾利用Abyss對(duì)非洲男性的基因組測(cè)序得到的35億對(duì)reads進(jìn)行組裝，獲得了覆蓋度達(dá)到了68%的全基因組框架圖譜［4］。SOAPdenovo［5］是華大基因開發(fā)的高通量從頭測(cè)序軟件，能構(gòu)建人類基因組大小的從頭拼接草圖。SOAPdenovo使用的Bruijn算法，是專門為處理Illumina GA產(chǎn)生的短reads而開發(fā)的，其為構(gòu)建參考基因組提供了新的途徑［6］。Velvet［7］是一款常用的基因組拼接軟件，采用的也是Bruijn算法，它能同時(shí)支持fasta、fastq格式的數(shù)據(jù)，同時(shí)支持多個(gè)文庫(kù)的數(shù)據(jù)同時(shí)使用。Velvet僅僅利用短reads和paired－ends信息，就可以產(chǎn)生可觀長(zhǎng)度的重疊群，Vevlet是目前短序列組裝的應(yīng)用較多的軟件，對(duì)細(xì)菌基因組十分適合。其工作的一般過程簡(jiǎn)化為：輸入短read序列，排除錯(cuò)誤，產(chǎn)生高質(zhì)量的contigs。然后用成對(duì)reads信息，檢索contigs之間的重復(fù)區(qū)域［8－9］。Ray［10］是需要使用MPI2.2來進(jìn)行de novo組裝的軟件。Ray是構(gòu)建在RayPlatform基礎(chǔ)上的組裝軟件，可以進(jìn)行平行運(yùn)算以及多個(gè)庫(kù)同時(shí)運(yùn)行。它可以同時(shí)拼接不同測(cè)序軟件的reads，在對(duì)應(yīng)的軟件下面有重要的參數(shù)說明。Ray可以同時(shí)拼接Roche/454和Illumina這三種測(cè)序工具測(cè)序得到的三種不同的基因組序列，結(jié)果表明這種混合拼接技術(shù)可以大大的減少拼接結(jié)果的錯(cuò)誤［11］。目前本研究團(tuán)隊(duì)完成了柞蠶微孢子蟲的染色體核型分析［12］，同時(shí)也初步完成了柞蠶微孢子蟲全基因組的測(cè)序，但對(duì)數(shù)據(jù)有效全基因組組裝，還處于空白。昆蟲微孢子蟲基因組一般具有大量的重復(fù)序列［13－14］，加大了組裝的難度，所以組裝軟件和組裝參數(shù)的選擇顯得十分重要。本文將通過比較不同的組裝軟件和組裝參數(shù)對(duì)柞蠶微孢子蟲的從頭組裝結(jié)果，通過比較N50的長(zhǎng)度，contig的條數(shù)，contigs的總長(zhǎng)度等來評(píng)價(jià)組裝結(jié)果，從中選擇最優(yōu)的組裝軟件和組裝參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 基因組數(shù)據(jù)來源

實(shí)驗(yàn)材料來源于重慶師范大學(xué)資源昆蟲及其病原微生物學(xué)研究室測(cè)序完成柞蠶微孢子蟲基因組數(shù)據(jù)。

1.2 組裝關(guān)鍵參數(shù)選擇

四種組裝軟件 Velvet（1.2.07）、Abyss（1.3.4）、SOAPdenovo（v1.04linux 32）Ray（v2.0.0）組裝時(shí)涉及到的參數(shù)很多，但是k－mer是其中最為關(guān)鍵的參數(shù)之一，因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同的k－mer進(jìn)行組裝結(jié)果的比較，而其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)。通過perl程序來測(cè)試不同的k－mer值.對(duì)于Velvet，Abyss，SOAPdenovo，Ray四種軟件我們也都通過編寫perl腳本程序，完成其他統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 不同的k－mer下基因組組裝質(zhì)量比較

采用四種軟件組裝后，結(jié)果顯示隨著k－mer的增加，組裝所得到的基因組全長(zhǎng)也是逐漸增加的，最大基因組總長(zhǎng)度在5～6M之間（如圖1a所示）。我們進(jìn)一步考察了四種軟件在各自不同k－mer值下最大的contig長(zhǎng)度，如圖1b所示，對(duì)于Ray和SOAPdenovo兩種軟件而言，當(dāng)k值設(shè)定在21～31的范圍內(nèi)，k－mer對(duì)最長(zhǎng)的contig大小影響不大。而對(duì)于Abyss來說，當(dāng)k＝23時(shí)最長(zhǎng)的contig大小明顯變大，而k＞23時(shí)這種變化趨穩(wěn)。對(duì)于Velvet來說，不同的k值對(duì)最長(zhǎng)contig大小影響最為顯著，具體來說，當(dāng)k＝25時(shí)最長(zhǎng)contig大小明顯高于k－mer＝21和k－mer＝23，而在k＝31時(shí)最為顯著。而比較四種軟件在k－mer數(shù)值最優(yōu)化后組裝的最長(zhǎng)contig長(zhǎng)度，Velvet所獲得的結(jié)果明顯優(yōu)于另外三種軟件。

N50是反映拼接效果最重要的參數(shù)，N50越大表明組裝結(jié)果也越好。如圖1c所示，在不同的k－mer下四種軟件得到的N50差別很大，N50Velvet＞N50Abyss＞N50Ray＞N50SOAPdenovo。從圖中我們可以看出，在設(shè)定的k－mer范圍內(nèi)N50Velvet總體上時(shí)隨著k－mer的增加而增加的，而N50Abyss是先增加后減小，在k－mer＝25時(shí)最大，而N50Ray、N50SOAPdenovo卻沒有明顯變化。Velvet的N50最大達(dá)到了47295bp，明顯高于其他三種軟件，而N50SOAPdenovo最小，小于1000bp。由此可見不同的k－mer值對(duì)不同軟件的拼接結(jié)果有顯著的影響，綜合以上分析，我們列出了不同軟件在最優(yōu)參數(shù)選擇下的組裝質(zhì)量結(jié)果，如表1所示。

圖1 不同組裝軟件下基因組組裝質(zhì)量

表1 四種軟件最優(yōu)k－mer化的拼接結(jié)果比較

2.2 四種軟件的硬件資源消耗

我們比較了四種軟件在最優(yōu)組裝條件下的系統(tǒng)資源消耗情況，如圖2a、圖2b所示，Velvet對(duì)CPU的消耗是相對(duì)小的，而內(nèi)存的消耗相對(duì)要高一點(diǎn)。而Abyss對(duì)硬件的消耗相對(duì)是最小的。拼接速度上來講，Abyss、Velvet速率相對(duì)較快，而Ray拼接最慢。

通過上面的分析可知，對(duì)于柞蠶微孢子蟲的基因組，通過比較N50的長(zhǎng)度，最大的contigs大小，contigs的總長(zhǎng)度等參數(shù)得知，Velvet的拼接結(jié)果相對(duì)最好，最適合柞蠶微孢子蟲的基因組組裝。在硬件消耗方面Velvet是最高的，但是拼接速度是最快的。

圖2 四種軟件的硬件資源消耗

3 討 論

本研究通過比較分析可知，不同的拼接軟件對(duì)柞蠶微孢子蟲的組裝結(jié)果差別非常大。其中Velvet軟件更適合進(jìn)行柞蠶微孢子蟲的基因組組裝。究其原因分析可能是由于柞蠶微孢子蟲基因組自身的結(jié)構(gòu)特殊性，即包含大量的重復(fù)序列，導(dǎo)致不同拼接的結(jié)果差異比較大，所以合理的選擇拼接軟件和參數(shù)對(duì)于拼接昆蟲微孢子蟲基因組十分重要的。通過本次研究，對(duì)今后柞蠶微孢子蟲基因組的分析具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。

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