叢慶偉，朱 英，吳可亞

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 感染科，遼寧 大連 116011)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一群具有免疫負(fù)調(diào)控功能的T細(xì)胞亞群，通過抑制其他免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活和增殖，可防止免疫過激或者自身免疫現(xiàn)象的發(fā)生。Foxp3特異性地表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞表面，CD4+CD25+Treg有賴于Foxp3的存在而發(fā)揮功能作用。

有研究發(fā)現(xiàn)甲型H1N1流感患者體內(nèi)該細(xì)胞數(shù)呈一過性降低，提示甲型H1N1流感病毒參與了機(jī)體免疫病理損傷[1-4]。本研究通過觀察甲型H1N1流感病毒滅活疫苗對(duì)小鼠CD4+CD25+Foxp3分子表達(dá)的影響，分析該疫苗對(duì)小鼠免疫細(xì)胞分子的調(diào)控作用，從而揭示該病毒致病的免疫病理機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 甲型H1N1流感病毒滅活疫苗免疫小鼠

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB/c 小鼠72只，雌雄各半，隨機(jī)分為高、中、低3個(gè)劑量組；以甲型H1N1流感病毒滅活疫苗免疫小鼠，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，皮下注射生理鹽水。每組18只。初次免疫時(shí)，高、中、低3個(gè)劑量組疫苗注射劑量分別為0.3 mL、0.2 mL和0.1 mL，腹腔/皮下接種小鼠；14 d后進(jìn)第2次免疫，免疫劑量減半。二次免疫10 d后，再以第1次劑量加強(qiáng)免疫。初次免疫后第4、8、12、19、26、34 天分別處死各組小鼠3只，取脾臟檢測(cè)。

1.2 FACS分析 CD4+CD25+Treg細(xì)胞表型

摘取小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液，加入Percoll液(Sigma公司)，提純脾淋巴細(xì)胞。用三色直接免疫熒光化學(xué)染色進(jìn)行FACS分析。純化的脾淋巴細(xì)胞用飽和濃度的熒光素標(biāo)記的大鼠抗小鼠單抗隆抗體進(jìn)行染色，所用抗體為CD4+FITC、CD25+APC、Foxp3-PE (均購自Biolegend公司)， FITC、PE、APC標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG作為同型對(duì)照(均購自BD公司) 。采用FACS Calibur和 CELLQuest軟件(BD公司)進(jìn)行分析，每次計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞大小、分子質(zhì)量進(jìn)行篩選，排除死亡的細(xì)胞團(tuán)。設(shè)Foxp3細(xì)胞門(R1門)、CD4+CD25+細(xì)胞(R2門)、CD4+CD25+Foxp3 細(xì)胞(R3門)。在 3次分選樣本中至少用每種抗體檢測(cè)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

隨著造模時(shí)間延長，F(xiàn)oxp3表達(dá)平均值第4、8、12、19、26、34天均無明顯差別，但0.1 mL實(shí)驗(yàn)組平均值比對(duì)照組明顯減少，0.3 mL組比對(duì)照組顯著升高，兩者差異均有顯著性意義(P<0.01)(表1)。CD4+CD25+實(shí)驗(yàn)組表達(dá)平均值第34天比第4天有所下降，差異有顯著性意義(P<0.05)，第8、12、19、26天與第4天相比均無明顯差別；0.1 mL實(shí)驗(yàn)組平均值與對(duì)照組相比顯著下降，0.3 mL組與對(duì)照組相比顯著升高，兩者差異均有顯著性意義(P<0.01)(表2)。CD4+CD25+Foxp3實(shí)驗(yàn)組表達(dá)平均值于注射第19、26天比第4天有所升高，差異有顯著性意義(P<0.05)，0.1 mL實(shí)驗(yàn)組平均值與對(duì)照組相比明顯升高，差異有顯著性意義(P<0.01)，其余時(shí)間點(diǎn)間無明顯變化(表3)。

3 討 論

20世紀(jì)70年代早期Gershon首次正式提出抑制性T細(xì)胞，Sakaguchi等[5]于1995年首次報(bào)道CD4+CD25+T細(xì)胞，T細(xì)胞具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，以“主動(dòng) ”的方式在維持外周免疫耐受中起關(guān)鍵作用。Sakaguchi等發(fā)現(xiàn)在正常人和小鼠的外周血及脾臟組織的CD4+T細(xì)胞中有一亞群細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)CD25+分子(L-2受體a鏈)，這種CD4+CD25+T細(xì)胞如缺乏可引起自身免疫性疾病。CD4+CD25+T細(xì)胞在人與小鼠中的分布是不同的，小鼠中占外周 CD4+T細(xì)胞 5%～10%，人占30%左右，其中 CD25high占1%～3%，為抑制性T細(xì)胞。根據(jù)CD4+CD25+Treg來源及作用機(jī)制等差異可將其分為天然 CD4+CD25+Treg和獲得性CD4+CD25+Treg。天然CD4+CD25+Treg是由胸腺T細(xì)胞自然分化發(fā)育成熟后進(jìn)人外周淋巴細(xì)胞組織的Treg，在預(yù)防病理性自身免疫反應(yīng)方面起作用。天然CD4+CD25+Treg在胸腺內(nèi)發(fā)育不僅依賴于低濃度、中等親和力的 MHC2Ⅱ/肽復(fù)合物或外周自身抗原在胸腺內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)提呈，而且也作為CD4+T細(xì)胞自然選擇的一部分以陰性選擇的方式存活下來。隨后Sakaguchi和Shevach的研究小組在1998年分別獨(dú)立建立了該細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，從而使其他學(xué)者能在體外研究該細(xì)胞的抑制活性[6-9]，直到2001年由Mason和Powry從人的血液中分離到了CD4+CD25+T細(xì)胞，并證實(shí)其對(duì)其他T細(xì)胞的增殖作用[10]。

表1 Foxp3表達(dá)變化Tab 1 Expression change of Foxp3

1) 與對(duì)照組比較，P<0.01

表2 CD4+CD25+表達(dá)變化Tab 2 Expression change of CD4+CD25+

1)與第4天比較，P<0.05；2)與對(duì)照組比較，P<0.01

表3 CD4+CD25+Foxp3表達(dá)變化Tab 3 Expression change of CD4+CD25+Foxp3

1)與第4天比較，P<0.05；2)與對(duì)照組比較，P<0.01

Foxp3是foxhead家族成員，2001年由Bennett CL等[11]首次報(bào)道，特異性表達(dá)于小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞。Foxp3蛋白在CD4+CD25+T細(xì)胞分化發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明通過紅或綠色熒光蛋白與Foxp3基因結(jié)合，能從單個(gè)細(xì)胞水平上研究CD4+CD25+T細(xì)胞，該方法證實(shí)只有CD4+CD25+Foxp3T細(xì)胞而非CD4+CD25+TregT細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能，可見 CD4+CD25+Treg功能的維持有賴于Foxp3的存在。Foxp3缺失或突變會(huì)造成CD4+CD25+T細(xì)胞生成障礙，機(jī)體免疫反應(yīng)變強(qiáng)，產(chǎn)生自身免疫病。

2009年流行的甲型H1N1流感[12-16]，主要導(dǎo)致青壯年人群患病，造成部分患者病情加重而死亡。有研究發(fā)現(xiàn)，感染該病毒患者的CD4+T淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)一過性的減少，提示甲型H1N1病毒的免疫損傷特性。

本研究中，應(yīng)用甲型H1N1流感病毒滅活疫苗免疫小鼠后，注射疫苗劑量在3個(gè)分組中對(duì)分子表達(dá)影響不同：在Foxp3和CD4+CD25+組中，0.1 mL組平均值比對(duì)照組降低、0.3 mL組比對(duì)照組升高，表明隨著注射疫苗劑量逐漸增加，對(duì)Foxp3和CD4+CD25+免疫分子表達(dá)有所影響；而在CD4+CD25+Foxp3組中，0.1 mL實(shí)驗(yàn)組平均值與對(duì)照組相比明顯升高，其余時(shí)間點(diǎn)間無明顯變化，表明低劑量注射流感疫苗就可引起CD4+CD25+Foxp3分子表達(dá)增強(qiáng)，因此該實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示CD4+CD25+Foxp3分子在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

隨著造模時(shí)間的延長，各時(shí)間點(diǎn)免疫分子表達(dá)平均值也不相同：Foxp3實(shí)驗(yàn)組第4、8、12、19、26、34天均無明顯差別；CD4+CD25+實(shí)驗(yàn)組第34天比第4天有所下降，第8、12、19、26天與第4天相比均無明顯差別；CD4+CD25+Foxp3實(shí)驗(yàn)組于注射第19、26天比第4天有明顯升高。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有CD4+CD25+Foxp3免疫分子對(duì)甲流病毒具有有效的免疫清除作用。

該研究發(fā)現(xiàn)，甲流疫苗免疫小鼠后出現(xiàn)機(jī)體免疫功能變化，使CD4+CD25+Foxp3 T細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，從而起到對(duì)抗甲流病毒對(duì)機(jī)體的免疫損傷的作用。因此本研究可以推斷，甲型H1N1流感病毒感染的一個(gè)重要機(jī)制是引起CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少，打破機(jī)體免疫耐受狀態(tài)，使機(jī)體免疫處于相對(duì)過激或亢進(jìn)狀態(tài)，而過度免疫可導(dǎo)致機(jī)體損傷。該研究結(jié)果與2009年甲流流行期間危重癥患者的發(fā)病特點(diǎn)相吻合，臨床報(bào)道通過檢測(cè)危重癥甲流患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞含量明顯降低。因此該研究得出結(jié)論，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少是甲型H1N1流感病毒感染機(jī)體的一個(gè)重要免疫病理基礎(chǔ)。

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