汪效松，雷惠新，張 旭，李智文，張志堅(jiān)

( 1.福建醫(yī)科大學(xué) 省立臨床醫(yī)學(xué)院 福建省立醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，福建 福州 350001；2.福建省神經(jīng)病學(xué)研究所，福建 福州 350005)

缺血/再灌注后神經(jīng)元存在著由ROS(活性氧)引起的氧化性DNA損傷，可繼發(fā)凋亡[1]。APE/Ref-1 蛋白是一種多功能蛋白，其內(nèi)所含的AP核酸內(nèi)切酶是ROS氧化性DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的限速酶，具有堿基切除修復(fù)功能，可針對(duì)此損傷過(guò)程進(jìn)行基因修復(fù)；此外，它又參與氧化還原反應(yīng)調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子(AP-1、核因子κB等)的DNA結(jié)合活性，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用[2]。亞低溫是目前存在的對(duì)試驗(yàn)性腦缺血損害最有效的治療方法[3-4],但其機(jī)理仍有許多不明之處。本研究旨在建立大鼠短暫性全腦缺血模型,觀察亞低溫對(duì)缺血敏感的海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡及APE/Ref-1蛋白表達(dá)的影響,試對(duì)亞低溫的腦保護(hù)機(jī)理作進(jìn)一步探索。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

健康清潔級(jí)雄性SD大鼠56只(由上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)，體重300～350 g，隨機(jī)分為3組: (1)假手術(shù)組8只；(2)常溫缺血組：分缺血10 min后常溫下存活1、2、3 d 3組，每組8只，共24只；(3)亞低溫缺血組：分缺血10 min后亞低溫3 h,存活1、2、3 d 3組。每組8只，共24只。

1.2 儀 器

動(dòng)物解剖學(xué)顯微鏡(型號(hào)SZ40，Olympus公司)；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)CH20-BIM，Olympus公司)；BL-310生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司)。

1.3 試 劑

原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(德國(guó)寶靈曼公司)；APE/Ref-1抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)；SP試劑盒(福州邁新生物工程公司提供)。

1.4 溫度控制

采用Maier等[5]的肛溫監(jiān)控方法。先取6只SD大鼠,同時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠腦溫、肛溫,求得腦溫與肛溫的相關(guān)方程,Y=0.946X+3.1334,其中,Y為腦溫(℃),X為肛溫(℃) (相關(guān)系數(shù)r=0.988,P<0.01)。以此方程校正大鼠的腦溫與肛溫的差別,從而確定后繼實(shí)驗(yàn)中亞低溫時(shí)相應(yīng)的肛溫。根據(jù)上述方法,進(jìn)行大鼠溫度控制。常溫缺血組: 保持肛溫35.8℃(相當(dāng)于腦溫37℃)；亞低溫缺血組: 在缺血后立即采用噴灑酒精+電扇降溫,在10 min內(nèi)使肛溫降至31.57℃(相當(dāng)于腦溫33℃),并維持3 h,而后使其體溫回升至正常(肛溫35.8℃,腦溫37℃)。

1.5 方 法

采用“雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷+低血壓法”建立大鼠短暫全腦缺血模型[6]。大鼠用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及股動(dòng)靜脈，進(jìn)行股動(dòng)靜脈置管，股動(dòng)脈導(dǎo)管連接血壓換能器監(jiān)測(cè)血壓。手術(shù)組(包括常溫缺血組和亞低溫缺血組)自股靜脈導(dǎo)管抽血，使平均動(dòng)脈壓降至35 mmHg左右。動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min，維持平均動(dòng)脈壓在(35±2.5)mmHg。缺血完畢立即將血自股靜脈回輸。假手術(shù)組只行血管分離，不予夾閉與抽血。

將各時(shí)間組大鼠再次麻醉，行腦灌注固定，石蠟包埋，腦海馬冠狀面6～8 μm連續(xù)切片。

3組切片均用免疫組化SP法檢測(cè)海馬神經(jīng)元中APE/Ref-1的表達(dá)(DAB顯色)。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。3組切片均行TUNEL染色。用不含A液的TUNEL反應(yīng)液作陰性對(duì)照。常溫缺血2 d組的切片行APE/Ref-1蛋白免疫組化與TUNEL雙重染色，蘇木素復(fù)染。

1.6 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為APE/Ref-1陽(yáng)性細(xì)胞；細(xì)胞核有紫黑色顆粒者為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞；細(xì)胞核被復(fù)染成淺藍(lán)色為既非APE/Ref-1陽(yáng)性又非TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞。每張切片高倍鏡下(×400)均計(jì)數(shù)大鼠腦海馬雙側(cè)CA1區(qū)各5個(gè)視野，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以假手術(shù)組APE/Ref-1免疫組化陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)作為海馬正常神經(jīng)元數(shù)，各組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)與之相比即為各組陽(yáng)性神經(jīng)元占正常的百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 APE/Ref-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元廣泛表達(dá)APE/Ref-1(圖1)。在常溫缺血后的1 d，海馬CA1區(qū)APE/Ref-1陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始減少，2 d時(shí)減少明顯，3 d時(shí)僅余少許(圖2)。亞低溫缺血后的2 d，海馬CA1區(qū)APE/Ref-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始減少，3 d時(shí)，減少程度有所增加(圖3)。與常溫缺血組相比，亞低溫缺血組在各時(shí)間點(diǎn)上APE/Ref-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目差異均有顯著性意義(表1)。

圖1 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)APE/Ref-1蛋白在神經(jīng)元胞核中廣泛表達(dá)(SP ×400)

圖2 常溫缺血組(存活3 d)大鼠海馬CA1區(qū)APE/Ref-1蛋白表達(dá)明顯減少 (SP ×400)

2.2 TUNEL 染色結(jié)果

假手術(shù)組和缺血后存活1 d 組未發(fā)現(xiàn)TUNEL染色陽(yáng)性神經(jīng)元, 缺血后存活2 d 及3 d 的常溫缺血組海馬CA1 區(qū)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元較同時(shí)間亞低溫缺血組的陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.01)(圖4、5)。溫度不同時(shí)各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦海馬CA1區(qū)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)見(jiàn)表2。

圖3 亞低溫缺血組(存活3 d)海馬CA1區(qū)APE/Ref-1陽(yáng)性神經(jīng)元 (SP ×400)

表1 常溫組與亞低溫組大鼠海馬CA1區(qū)不同存活時(shí)間APE/Ref-1陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)比較

1)與亞低溫組比較，P<0.01

圖4 常溫缺血組(存活3 d)大鼠海馬CA1區(qū)大量TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元 (TUNEL染色 × 400)

2.3 APE/Ref-1蛋白免疫組化與TUNEL雙重染色

缺血后2 d腦組織切片行APE/Ref-1蛋白免疫組化和TUNEL雙重染色可觀察到3種不同細(xì)胞：APE/Ref-1陽(yáng)性細(xì)胞、TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞及既無(wú)APE/Ref-1陽(yáng)性又無(wú)TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞。未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性與APE/Ref-1陽(yáng)性同處于一個(gè)細(xì)胞中(圖6)。

圖5 亞低溫缺血組(存活3 d)海馬CA1區(qū)僅可見(jiàn)少許TUNEL染色陽(yáng)性的神經(jīng)元(TUNEL染色 × 400)

表2 常溫組與亞低溫組大鼠海馬CA1區(qū)不同存活時(shí)間TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)比較

1)與亞低溫組比較，P<0.01

圖6 常溫缺血組(存活2 d)大鼠海馬CA1區(qū)APE/Ref-1蛋白免疫組化與TUNEL雙重染色 ×400

2.4 不同溫度全腦缺血后APE/Ref-1的變化與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系

以上文得出的表1部分和表2部分中不同溫度下的APE/Ref-1陽(yáng)性細(xì)胞百分比與TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比值為依據(jù)，作出不同溫度下短暫性全腦缺血后海馬CA1區(qū)APE/Ref-1陽(yáng)性細(xì)胞百分比與TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比隨時(shí)間變化圖，見(jiàn)圖7、8。

圖7 海馬CA1區(qū)常溫缺血后APE/Ref-1陽(yáng)性細(xì)胞與TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞時(shí)間變化圖

圖8 海馬CA1區(qū)亞低溫缺血后APE/Ref-1陽(yáng)性細(xì)胞與TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞時(shí)間變化圖

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦中風(fēng)發(fā)生早期，缺血中心區(qū)腦血流急劇下降，神經(jīng)細(xì)胞死亡以壞死為主；而缺血中心區(qū)周?chē)?缺血半暗帶)的神經(jīng)細(xì)胞仍然具有代謝活力，其后續(xù)的死亡以凋亡為主，其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為核固縮、胞膜發(fā)泡及凋亡小體的形成，DNA在寡核小體間裂解，在凝膠電泳時(shí)呈現(xiàn)明顯的“DNA Ladder”[7]。

APE/Ref-1蛋白被認(rèn)為是自身DNA修復(fù)機(jī)制中的關(guān)鍵成分，具有DNA堿基切除修復(fù)功能[8]，在腦缺血時(shí)，能修復(fù)損傷的神經(jīng)元DNA，防止凋亡的發(fā)生。APE/Ref-1蛋白減少，會(huì)使得部分DNA損傷后不能得到有效的修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。既往研究表明，APE/Ref-1蛋白表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞，對(duì)誘發(fā)DNA損傷的各種因素敏感性增強(qiáng)[9]。

本研究顯示，10 min的短暫性全腦缺血/再灌注引致的神經(jīng)元死亡主要表現(xiàn)為對(duì)缺血敏感的海馬CA1區(qū)巨錐體細(xì)胞的遲發(fā)性死亡。這種遲發(fā)性神經(jīng)元死亡主要為凋亡，發(fā)生在缺血后的2～3 d，以3 d時(shí)明顯。正常情況下，APE/Ref-1蛋白在海馬神經(jīng)元細(xì)胞核中廣泛表達(dá)。缺血后1 d，已可觀察到海馬CA1區(qū)APE/Ref-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始減少，2 d減少明顯，3 d僅存少許。從缺血時(shí)間與陽(yáng)性細(xì)胞百分比圖可以看出海馬CA1區(qū)APE/Ref-1蛋白的減少和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多明顯相關(guān)。APE/Ref-1蛋白的減少要早于TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多。缺血后2 d腦組織同一張片上APE/Ref-1蛋白免疫組化和TUNEL雙重染色可觀察到APE/Ref-1陽(yáng)性細(xì)胞、TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞及既無(wú)APE/Ref-1陽(yáng)性又無(wú)TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞，未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性與APE/Ref-1陽(yáng)性同處于一個(gè)細(xì)胞中。這既說(shuō)明APE/Ref-1的減少要早于凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)，又提示失去APE/Ref-1陽(yáng)性的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞。

亞低溫是目前缺血后腦損傷最有效的保護(hù)措施之一[3-4]。大量的研究表明，亞低溫起效的機(jī)制是多重性的，它能在多個(gè)水平上阻止腦梗死后缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)展，從而減少神經(jīng)元壞死和凋亡，抵抗腦缺血再灌注損傷，持久的保護(hù)神經(jīng)元形態(tài)和功能免受損害[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)顯示,與常溫缺血組相比,實(shí)行亞低溫的大鼠海馬CA1區(qū)中APE/Ref-1 染色陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)目在缺血后減少不明顯, 再結(jié)合TUNEL 染色結(jié)果,亞低溫同時(shí)也抑制神經(jīng)元的凋亡。而如上述，在腦缺血后APE/Ref-1的減少要早于凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)，且失去APE/Ref-1陽(yáng)性的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞。因此，亞低溫可能通過(guò)對(duì)APE/Ref-1蛋白的保護(hù)而抑制神經(jīng)元的凋亡。

APE/Ref-1蛋白被認(rèn)為是自身DNA修復(fù)機(jī)制中的關(guān)鍵成分，因此，從本實(shí)驗(yàn)可以推測(cè)亞低溫可能對(duì)缺血后神經(jīng)元自身DNA修復(fù)機(jī)制有保護(hù)作用，且可能通過(guò)對(duì)此機(jī)制的保護(hù)而抑制神經(jīng)元的凋亡。

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