王 琪，樸豐源

(1. 中國醫(yī)科大學 96期臨床醫(yī)學班，遼寧 沈陽 110001；2. 大連醫(yī)科大學 勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學教研室，遼寧 大連 116044)

砷是一種廣泛存在的環(huán)境污染物。急、慢性砷暴露可導致生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚等多組織器官的損害，嚴重危害人類的健康。近年來，砷對男性生殖系統(tǒng)的毒性作用備受關注[1-2]。Hsieh等[1]通過流行病學調(diào)查和臨床觀察發(fā)現(xiàn)砷對男性生殖系統(tǒng)有一定的毒性作用。Chiou等[2]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)砷可損害實驗動物的精子生成功能，導致雄性生殖系統(tǒng)功能異常。以上文獻均提示，男性生殖系統(tǒng)可能是砷毒性作用的主要靶器官之一，但其毒作用機制并不十分清楚。目前認為編碼于Y染色體的性基因參與調(diào)節(jié)雄性生殖功能。本課題組在近期動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，砷暴露顯著影響一些性基因的表達[3-4]。Eif2s3y是Y染色體性基因，不僅在雄性生殖系統(tǒng)中表達，在腦組織中也有高表達，與精子的發(fā)育調(diào)控密切相關[5-6]。因此，本研究就亞慢性砷暴露對雄性小鼠腦組織Eif2s3y表達影響進行觀察，以便為探討砷的雄性生殖毒作用機制提供靶基因依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

三氧化二砷(As2O3)；TRIzol 試劑盒(美國Invitrogen公司)；RNeasy Mini Kit(德國OIAGEN公司)； DEPC-Water (美國Ambion公司)； Herring Sperm DNA (美國Promega公司); BSA(美國Invitrogen公司); MOPS (上海Sagon公司); β-Mercaptoethanol (上海Sagon公司); Normal Goat IgG (美國Sigma公司)； 氯仿(天津市福晨化學試劑廠)；異丙醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)；乙醇(沈陽新興試劑廠)；TRNzol-A+總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司)；Quant cDNA 第一鏈合成試劑合(天根生化科技有限公司)；2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司)。

1.2 設 備

GeneArrayTM掃描儀3000(Affymetrix公司)；全自動芯片洗滌工作站450 (Affymetrix公司)；基因芯片雜交箱640(Affymetrix公司)；Microarray Suite Version 5.0分析軟件(Affymetrix公司)等；754紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)； PCR儀(Thermo Electron Co,美國)；UVP凝膠電泳拍攝分析系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.3 實驗動物及處理

SPF級雄性小鼠30只，體重(20±2)g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。按體重將小鼠隨機分為3組，即生理鹽水對照組、低劑量組染砷組(1 mg/L As2O3和高劑量組染砷組(4 mg/L As2O3)，每組10只。小鼠正常飲食，通過自然飲用含不同濃度As2O3蒸餾水的方式使小鼠染毒，連續(xù)染毒60 d。染毒結(jié)束后，將小鼠斷頭處死并立即取腦儲存于RNA lazer 液中，低溫保存。

1.4 總RNA的提取和基因芯片雜交

分別將各實驗組(1 mg/L和4 mg/L As2O3)和對照組的小鼠大腦和小腦在液氮中進行研磨，依TRIzol 試劑盒操作說明從腦組織中抽提總RNA，用RNeasy Mini Kit進行純化。提取的RNA在紫外分光光度儀下測定RNA的濃度和純度，同時變性膠電泳檢測RNA有無降解；然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNA轉(zhuǎn)錄標記試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA探針，合成的同時進行生物素標記；生物素標記的cRNA探針經(jīng)片段化處理后與Mouse Genome 430 2.0 Araay基因芯片在雜交箱640中45℃雜交16 h，然后于全自動芯片洗滌工作站450中洗脫、染色；最后用GeneArrayTM 掃描儀3000掃描雜交信號。

1.5 芯片數(shù)據(jù)處理和生物學信息分析

雜交結(jié)果用Affymetrix公司的Microarray Suite Version 5.0軟件進行分析。在對單個樣本表達分析的前提下，根據(jù)P<0.04為表達，0.04～0.06為臨界，P>0.06為不表達，分別建立對照組、低劑量染砷組，高劑量染砷組腦組織的基因表達譜；然后將二者的基因表達譜進行比較，根據(jù)signal log ratio (SLR)值判斷。SLR>1(即表達倍數(shù)>21)為表達上調(diào)，SLR<-1(即表達倍數(shù)<2-1)為表達下調(diào)，篩選得到在對照組、低劑量染砷組，高劑量染砷組中差異表達的基因探針號輸入NetAffy網(wǎng)站(www.affymetrix.com)中進行批量處理查詢(Batch Query)，查詢出相對應的基因和生物學信息。

1.6 RT-PCR

按試劑盒說明提取總RNA。RT- PCR 反應條件為，Eif2s3y為: 94℃變性3 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，72℃充分延伸7 min；β-actin：94 ℃變性3 min,94℃變性30 s,58 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，72℃充分延伸7 min。 RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)照相。同β-actin比較。引物設計見表1。

表1 引物設計Tab1 Primer design

1.7 統(tǒng)計學方法

用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析。用方差和LSD檢驗分析PCR檢測的mRNA表達相對值的多組間差異,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 染砷組小鼠腦組織Eif2s3y基因芯片篩選結(jié)果

在小鼠大腦和小腦中，與對照組比較，高劑量染砷組和低劑量染砷組Eif2s3y基因表達均上調(diào)。見表2。

表2 染砷小鼠腦組織Eif2s3y基因表達的芯片結(jié)果

與對照組比較，染砷組小鼠腦組織基因表達顯著上調(diào)(表達倍數(shù)>2)。

2.2 染砷小鼠大腦皮質(zhì)Eif2s3y的 RT-PCR結(jié)果

與對照組比較，染砷小鼠大腦皮質(zhì)Eif2s3y的mRNA表達量隨染砷濃度的增高而增加，尤其4 mg/L染砷組Eif2s3y表達最為明顯。β-Actin作為內(nèi)參(圖1)。

2.3 染砷小鼠大腦髓質(zhì) Eif2s3y的 RT-PCR結(jié)果

染砷小鼠大腦髓質(zhì)Eif2s3y的mRNA表達量均比對照組增加，尤其4 mg/L染砷組Eif2s3y表達最為明顯。β-Actin作為內(nèi)參(圖2)。

2.4 染砷小鼠小腦Eif2s3y的 RT-PCR結(jié)果

染砷小鼠小腦Eif2s3y的 mRNA表達量與對照組比較，無明顯變化。β-Actin作為內(nèi)參(圖3)。

圖1 小鼠大腦皮質(zhì)Eif2s3y的mRNA表達

圖2 小鼠大腦髓質(zhì)Eif2s3y的mRNA表達

圖3 小鼠小腦Eif2s3y的mRNA表達

3 討 論

砷可通過血液和腦脊液進入腦實質(zhì)而損傷腦組織[7]，導致腦功能失調(diào)而引起一系列的臨床表現(xiàn)。腦不僅調(diào)節(jié)機體的記憶和行為功能還參與調(diào)節(jié)機體的生殖功能。丘腦-垂體-睪丸軸調(diào)節(jié)著男性激素水平和生殖功能[8]。通過下丘腦-垂體-性腺軸的反饋及負反饋作用來調(diào)節(jié)內(nèi)分泌激素，使外周激素的水平保持相對穩(wěn)定，而外周激素的水平保持相對穩(wěn)定對維持男性生殖功能的正常是一個重要因素。最近研究表明性基因在腦中表達也參與調(diào)節(jié)機體的外周性激素的水平。Y染色體基因表達雄性遺傳信息，參與調(diào)節(jié)雄性動物內(nèi)分泌和行為等功能。Eif2s3y是在雄性動物腦中表達的主要Y染色體基因， 其編碼的蛋白參與調(diào)節(jié)雄性生殖功能[9]。本研究的基因芯片結(jié)果顯示，砷暴露雄性小鼠大腦皮質(zhì)Eif2s3y基因的表達增多。且RT-PCR結(jié)果也顯示，砷暴露雄性小鼠大腦皮質(zhì)和髓質(zhì)Eif2s3y的mRNA表達顯著高于對照組。本研究結(jié)果表明，亞慢性砷暴露可能顯著上調(diào)Eif2s3y基因在雄性小鼠大腦組織的表達。而砷暴露小鼠小腦組織，其Eif2s3y的mRNA表達在基因芯片結(jié)果顯示明顯高于對照組。但RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較砷暴露雄性小鼠小腦組織Eif2s3y的mRNA表達沒有顯著增多。對于這兩種基因表達檢測方法測定結(jié)果的不一致，可能需要用更精確的實時定量PCR加以確認。

Eif2s3y很可能是砷雄性生殖毒性作用的一個靶基因。今后有必要進一步從蛋白質(zhì)水平驗證亞慢性染砷對大腦組織Eif2s3y表達的影響，同時通過一系列干預實驗探討砷對小鼠腦組織Eif2s3y基因表達的影響與小鼠雄性生殖功能異常之間的因果關系是非常必要的。

[1] Hsieh FI, Hwang TS, Hsieh YC, et al. Risk of erectile dysfunction induced by arsenic exposure through well water consumption in Taiwan[J]. Environ Health Perspect, 2008, 116: 532-536.

[2] Chiou TJ, Chu ST, Tzeng WF, et al. Arsenic trioxide impairs spermatogenesis via reducing gene expression levels in testosterone synthesis pathway[J]. Chem Res Toxicol, 2008, 21: 1562-1569.

[3] Li Y, Wang M, Piao F, et al. Subchronic exposure to arsenic inhibits spermatogenesis and down-regulates the expression of Ddx3y in testis and epididymis of mice[J]. Toxicol Sci, 2012, 128(2): 482-489.

[4] 齊巖，樸豐源. 亞慢性砷暴露對雄性小鼠腦組織性基因Jarid1d表達的影響[J].大連醫(yī)科大學學報, 2011, 33(2): 107-110.

[5] Xu J, Distechea CM. Sex differences in brain expression of X- and Y-linked genes[J]. Brain Res, 2006, 1126: 50 - 55.

[6] Touré A, Szot M, Mahadevaiah SK, et al. A new deletion of the mouse Y chromosome long arm associated with the loss of Ssty expression, abnormal sperm development and sterility[J]. Genetics, 2004, 166: 901-912.

[7] Biswas U，Sarkar S，Bhowmik MK，et al．Chronic toxicity of arsenic in goats：Clinical biochemical changes，pathomorphology and tissue residues[J]．Small Rumin Res, 2000，38：229-235．

[8] Jana K, Jana S, Samanta PK. Effects of chronic exposure to sodium arsenite on hypothalamo-pituitary-testicular activities in adult rats: possible an estrogenic mode of action[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2006, 4: 1-13.

[9] Akimoto C, Kitagawa H, Matsumoto T, et al. Spermatogenesis-specific association of SMCY and MSH5[J]. Genes Cells, 2008, 13: 623-633.