劉 鑫，熊 斌，張耀華，周紅審，陳麗華

（1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，武漢 430051；2.河南平頂山工學(xué)院，河南 平頂山 467036）

近年來，有關(guān)吸煙與健康的研究結(jié)果表明，卷煙煙氣自由基可直接損傷機(jī)體內(nèi)細(xì)胞和酶等物質(zhì)，并與DNA結(jié)合使細(xì)胞轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生突變；其間接毒性可在體內(nèi)激活和產(chǎn)生大量活性更高、毒性更大的其他自由基，如超氧自由基和羥基自由基，從而導(dǎo)致多種病變[1]。目前，合成抗氧化劑往往有毒副作用，它們逐步被取代是大勢所趨。因此，開發(fā)出高效無毒的天然自由基清除劑應(yīng)用于卷煙制品，對于降低吸煙的危害具有十分重要的意義。

訶子系君子科植物訶子樹（Terminalia ChebulaRitz）的果實(shí)，原產(chǎn)印度、緬甸等國，在西藏、云南等省區(qū)均有分布?！端幮哉摗酚涊d其“味酸澀、溫?zé)o毒”，有斂肺、澀腸、下氣之功效。藥理試驗(yàn)表明，訶子具有明顯的抗艾滋病、抑制惡性腫瘤、抑菌等作用，它含有約30%～40%[2]的鞣質(zhì)，而訶子鞣質(zhì)具有良好的抗氧化功能[3-6]。訶子在醫(yī)藥及油脂抗氧化方面的研究較多，而對降低香煙煙氣自由基含量的應(yīng)用報(bào)到較少[7-8]，且多為粗提物，作用成分不明。本研究對訶子提取物進(jìn)行色譜純化，并通過顯色反應(yīng)、UV和H1NMR檢測后確認(rèn)其清除自由基的活性物質(zhì)主要為訶黎勒酸衍生物或訶子單寧水解碎片等，為訶子提取物作為煙用自由基清除劑提供了有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

訶子購于中藥城，DPPH·購于Sigma-Aldrich公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。試驗(yàn)于2008—2009年進(jìn)行。

1.2 主要儀器及設(shè)備

721紫外可見分光光度計(jì)；ZF-C三用紫外分光計(jì)；TGL-18C高速臺式離心機(jī)；HG101-1B電熱鼓風(fēng)干燥箱；2110 Fraction collector離心沉淀器。

1.3 方法

1.3.1 訶子中清除自由基活性成分的提取與分離200 g訶子粉（粉碎至40目）以甲醇回流提取2次（固液比1:6），每次2 h，合并濾液，濃縮至浸膏狀，浸膏用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮至干，稱重，定容并計(jì)算得率和濃度。

1.3.2 顯色法跟蹤試驗(yàn) 根據(jù)三氯化鐵溶液、茴香醛-硫酸、亞硝酸鉀-醋酸溶液、碘酸鉀飽和溶液、α-萘酚等顯色試驗(yàn)[9]來判斷其主要成分類別。

1.3.3 DPPH·法活性跟蹤試驗(yàn) 將提取物（分別以提取劑為溶劑）、茶多酚和特丁基對苯二酚（TBHQ，以甲醇為溶劑）分別配成5個(gè)濃度梯度溶液。再將DPPH·用各對應(yīng)溶劑分別配成1×10-4mol/L的溶液7份。取2 mL不同濃度的樣品溶液分別加入到2 mL相對應(yīng)的 D P P H·溶液中，總體積4 mL，搖勻，25 ℃保溫30 min，于517 nm測定吸光值（A樣品）（以2 mL樣液+2 mL對應(yīng)溶劑混合調(diào)零）。2 mL相應(yīng)溶劑加到2 mL DPPH·液中空白對照，測定空白的吸光值（A空白）（以4 mL對應(yīng)純?nèi)軇┱{(diào)零）[10]。

計(jì)算抑制率公式為：

抑制率（%）=（A空白－A樣品）/A空白×100%

1.3.4 乙酸乙酯和甲醇組分的色譜純化 分別對乙酸乙酯和甲醇組分進(jìn)行硅膠柱層析，從乙酸乙酯組分得色譜純組分a和b；甲醇組分得到色譜純組分c。

1.3.5 色譜純成分的結(jié)構(gòu)鑒定 對a、b、c溶液進(jìn)行顯色試驗(yàn)、紫外（UV）和核磁共振法（H1NMR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 濃度和得率

按照試驗(yàn)方法對訶子進(jìn)行分步提取，甲醇提取物和乙酸乙酯得率分別為40.8%和4.18%。

2.2 甲醇和乙酸乙酯提取物的活性跟蹤

2.2.1 顯色反應(yīng)跟蹤 提取物組分顯色試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2.2 DPPH·法活性跟蹤 采用DPPH·法活性跟蹤法測定不同濃度下的A值，計(jì)算其抑制率，并繪制其抑制率曲線如圖1。

觀察抑制率曲線發(fā)現(xiàn)：（1）TBHQ和甲醇組分的抑制率較高，但隨濃度升高數(shù)值變化不大，即對自由基的清除效果的量效關(guān)系并不明顯。（2）茶多酚和乙酸乙酯組分呈上升狀，表明其活性與濃度成正比關(guān)系，但乙酸乙酯組分清除自由基的活性弱于茶多酚。

2.3 乙酸乙酯和甲醇組分的色譜純化

乙酸乙酯和甲醇提取物顯色試驗(yàn)中均呈現(xiàn)不同程度的藍(lán)綠色，說明均含有多酚類物質(zhì)，進(jìn)一步對乙酸乙酯和甲醇提取物進(jìn)行硅膠柱層析。柱層析純化過程中，采用薄層分析板三氯化鐵顯色跟蹤，最后得色譜純兩個(gè)純組分，重量分別為2.689 g和0.026 g，用甲醇分別定容到 50 mL后，濃度各為53.79 g/L和0.52 g/L，分別命名為樣a和b。甲醇組分色譜純化后重0.385 g，用甲醇定容50 mL，其濃度為7.04 g/L，命名為樣c。

表1 兩組分顯色試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The color test of the purified components

圖1 甲醇組分、乙酸乙酯組分、茶多酚及TBHQ對DPPH·的抑制活性Fig.1 Methanol fractions, the ethyl acetate fractions, tea polyphenol and TBHQ on DPPH· inhibitory activity

2.4 色譜純組分清除自由基活性檢測和化學(xué)成分定性鑒定

2.4.1 顯色法定性鑒定 濾紙層析和 α-萘酚法對色譜純組分a、b、c顯色，其結(jié)果如表2和圖2所示。條形紙層析在BAW 和 6%的冰乙酸中展開，并在紫外燈254 nm下觀察，其顯色結(jié)果見表3。

綜合表2、3的顯色結(jié)果，可以推斷樣a屬水解單寧中的棓單寧，是多個(gè)棓酸與鄰苯三酚型酚羥基醇形成的六羥基聯(lián)苯二酸酯；樣b為縮合單寧，由于含有鄰苯二酚的單寧在三氯化鐵溶液顯色下才呈綠色，它是羥基黃烷類單體形成的縮合物，單體間以碳-碳鍵連接，遇濃硫酸生成暗紅棕色沉淀；樣c的紙層析在紫外燈254 nm下觀察呈紫色[11]，在BAW的上層和6%的醋酸中它們的Rf值分別為0.42和0.12，這與葡萄糖棓酸酯在紫外光下的呈色以及紙色譜上以BAW為展開劑的比移值（Rf）大體相近，至于6%的醋酸為展開劑時(shí)，其Rf值隨分子中棓?；膫€(gè)數(shù)增加而下降。根據(jù)上述推測，它的結(jié)構(gòu)應(yīng)為 1β,2,3,4,6-五-O-棓酰-β-D-吡喃葡萄糖。

表2 色譜純組分a、b、c顯色情況Table 2 The color test of the purified components

圖2 色譜純組分濾紙層析樣圖Fig.2 Chromatography paper chromatography sample of the purified components

表3 條形紙層析顯色結(jié)果Table 3 The color test of the strip paper chromatography

2.4.2 紫外（UV）和核磁（NMR）結(jié)構(gòu)測定結(jié)果 從紫外圖譜上觀察，a樣的UV（MeOH）的波峰為219、202.5、275 nm，b樣UV（MeOH）的波峰為200、220 nm，c樣的UV（MeOH）的波峰為274、205、222.5 nm。根據(jù)參考文獻(xiàn)[2]中的數(shù)據(jù)，a樣與訶黎勒酸的波峰相對應(yīng)，可大概判斷為訶黎勒酸。b樣和c樣的紫外波峰數(shù)據(jù)沒有記載，但b和c的顯色反應(yīng)表明它們具有訶子單寧的特征，結(jié)合核磁圖譜（圖3、4）分析推測，它們屬訶子大家庭中的一員，是訶黎勒酸的變體或訶子單寧的水解碎片。組分 b和c的推測結(jié)構(gòu)見圖5、6。

圖3 b組分核磁圖譜Fig.3 The H-NMR spectra of the b component

圖4 c組分核磁圖譜Fig.4 The H-NMR spectra of the c component

圖5 核磁圖譜推測b組分結(jié)構(gòu)Fig.5 b component structure

圖6 核磁圖譜推測c組分結(jié)構(gòu)Fig.6 c component structure

2.4.3 色譜純組分抑制DPPH·活性的檢測結(jié)果 采用DPPH·法活性跟蹤法測定a、b、c樣不同濃度下的A值，計(jì)算其抑制率，結(jié)果見表4。

表4 色譜組分a、b、c各濃度下的抑制率Table 4 The purified component on DPPH· inhibitory activity

試驗(yàn)結(jié)果表明，純化后 a、b、c樣的清除DPPH·自由基的效果有了明顯的提高，a、b樣的最大抑制率分別為其所在乙酸乙酯粗提取物的1.6倍和 1.1倍，c樣的最大抑制率為其所在甲醇粗提取物的1.1倍，其中清除效果最好的c樣比茶多酚還好，同時(shí)是TBHQ的1.2倍。

3 結(jié) 論

（1）訶子甲醇提取物和乙酸乙酯提取物，對清除自由基都具有一定的效果。甲醇組分的抑制率較高，但隨濃度升高數(shù)值變化不大；乙酸乙酯組分的活性與濃度成正比關(guān)系。

（2）甲醇提取物和乙酸乙酯提取物純化后活性提高，其純化后a、b、c樣最大抑制率分別為其所在提取物的1.6、1.1和1.1倍。其主要活性物質(zhì)為棓單寧、鞣花單寧及水解單寧碎片等多酚類物質(zhì)。

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