梁計林, 龍麗娟

(1．中國科學(xué)院 南海海洋研究所 廣東省海洋藥物重點實驗室, 廣東 廣州 510301; 2．海南省海洋監(jiān)測預(yù)報中心, 海南 海口 570206)

海洋有毒甲藻Coolia monotis的研究概況

Review of marine toxic dinoflagellateCoolia monotis

梁計林1,2, 龍麗娟1

(1．中國科學(xué)院 南海海洋研究所 廣東省海洋藥物重點實驗室, 廣東 廣州 510301; 2．海南省海洋監(jiān)測預(yù)報中心, 海南 海口 570206)

甲藻(Pyrrophyta)又稱雙鞭毛藻(Dinoflagellates),是海洋浮游植物的重要種群之一, 其種類繁多, 全世界已記錄的約有130個屬, 1200個代表種。隨著赤潮的頻繁出現(xiàn)及赤潮毒素的強效活性的發(fā)現(xiàn), 有毒甲藻的危害及醫(yī)藥作用日益引起人們的重視。赤潮毒素是海洋生物活性物質(zhì)中研究、開發(fā)進展最為迅速的領(lǐng)域之一。本文以南中國海常見的一種海洋附生有毒甲藻Coolia monotis為論述對象, 從分類學(xué)、生理學(xué)和化合物研究3個層次對其進行綜述。

1 分類學(xué)研究

Coolia是甲藻門的一個屬, 1919年由Meunier確立, 中國內(nèi)地未定其中文名, 中國臺灣地區(qū)用庫里亞藻稱之。迄今共報道共有 3個種, 分別為Coolia monotisMeunier、Coolia tropicalisFaust以及 2000年由 Ten-Hage宣布發(fā)現(xiàn)的印度洋新種Coolia areolataTen-Hage。C.monotis是棕黃色近圓形單胞藻,具兩條鞭毛, 為光合自養(yǎng)型, 葉綠體呈圓盤狀, 個體直徑大小25～50μm。

由于C.monotis在形態(tài)上與其他一些藻類很相似,其分類地位的確定曾出現(xiàn)過反復(fù)[1-2]。Ehrenberg和Schimdt分別在1837年和1901年用光學(xué)顯微鏡觀察,把其歸入Glenodinium屬和Ostreopsis屬。1919年,Meunier則根據(jù)甲片排列形式把其從Ostreopsis屬中獨立出來, 單獨成立為Coolia屬。1937年Schiller[3]發(fā)現(xiàn)C.monotis的上殼甲片結(jié)構(gòu)與Ostreopsis屬極相似, 將其又歸Ostreopsis屬中。一直到了20世紀(jì)80年代, Steinta提出以甲片排列形式作為多甲藻目分類的依據(jù), 大家的意見才開始趨于一致。

掃描電鏡(SEM)是現(xiàn)代顯微觀測的有效手段,它可以清楚地觀察到C.monotis的殼板組成和殼上的小孔。借助SEM, 多位科學(xué)家[4-5]對C. monotis的分類地位進行了重新認(rèn)定。1992, Faust[6]利用SEM對C. monotis的形態(tài)進行觀察, 從甲片的排列形式上鑒定此種, 并詳細描述了此種的形態(tài)結(jié)構(gòu), 將其劃入Coolia屬中。1997, Rhodes等[7]對于澳大利亞海域采集的Coolia進行 SEM觀察。發(fā)現(xiàn)分離出的Coolia個體較 Faust描述的C. monotis要小些, 而與C.tropicalis相近, 但經(jīng)過殼板尤其是上甲殼甲板的對比從而確定為C. monotis。

2 生理生態(tài)學(xué)研究

C.monotis是廣溫廣鹽種, 世界范圍內(nèi)的熱帶、亞熱帶海域多有分布, 生活在近岸淺海。有實驗證明C.monotis能在鹽度 15～60的環(huán)境中存活[8], 溫度16～32℃間仍能生長[9]。C.monotis具有浮游、底棲、附生3種生活形態(tài)。C.monotis細胞底部的小孔能分泌黏液[6], 用以附著在大型藻體上, 群體在水體中分泌的這些黏液通常黏連成網(wǎng)狀, 蔓布在海草間[10]。

Faust[6]用干涉對比的方法在光學(xué)顯微鏡下對實驗室培養(yǎng)的C.monotis進行了生活狀態(tài)的觀察, 發(fā)現(xiàn)C.monotis存在無性生殖和有性生殖兩種繁殖方式。據(jù)一些學(xué)者[11-12]的觀點, 海藻在營養(yǎng)條件良好時主要以前者為主要繁殖方式, 當(dāng)培養(yǎng)條件發(fā)生變化——通常是養(yǎng)分損耗的時候, 又尤其是氮含量降低的情況下會誘發(fā)有性生殖。C.monotis的有性生殖在其天然棲息地——紅樹林海域曾被觀察到, 那里的沉積物中氮含量比較低, 約為5mg/g[13]。除營養(yǎng)鹽濃度因素外, 其他因素也是發(fā)生有性生殖的誘發(fā)原因。在誘發(fā)有性生殖的實驗中, Faust[6]采用了較野外水溫 24～32.5℃低的 23℃; 光暗周期也由野外的13h:11h變?yōu)?0h:14h; 鹽度則由野外33～38固定為36; 光照強度則降低至1 900～5 700 lx, 低于野外的9 500～12 000 lx。C.monotis的無性生殖為等二分裂,有性生殖以同配生殖方式進行。

對于C.monotis的實驗室培養(yǎng), 各個實驗室根據(jù)實驗?zāi)康牡牟煌x擇了不同的培養(yǎng)條件,其中多數(shù)的培養(yǎng)目的是用于動物實驗以測定其是否具有毒性,尚未有過全面綜合的最適培養(yǎng)條件及最大培養(yǎng)密度測定。這些實驗中采用的培養(yǎng)基有ES-1、GP以及f/2等[6,14]。溫度、光照等其他條件根據(jù)各自實驗情況的不同在C.monotis的存活范圍內(nèi)選擇。從培養(yǎng)的結(jié)果比較來看, 劉寧寧等[9]進行的單因子生長條件實驗在28℃、鹽度34、光暗周期12h : 12h、光照強度約2 000 lx, 使用2倍改良K培養(yǎng)液的條件下, 獲得了最大的細胞密度, 為6×104個/mL, 這是迄今為止有報道的最大培養(yǎng)密度。

3 化合物研究

海洋甲藻通常具毒性, 被認(rèn)為是造成有害赤潮的元兇, 但隨著赤潮毒素的強效活性的發(fā)現(xiàn), 有毒甲藻的醫(yī)藥作用日益引起人們的重視。因此從甲藻中分離出毒素, 測定其分子結(jié)構(gòu)并進行藥理、藥化研究以闡明其致毒機理, 在充分了解其構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)上將其作為模型化合物進行輔助基團改造等化學(xué)修飾, 以期在確保療效的基礎(chǔ)上降低毒性, 已成為研究毒素類海洋治療藥物的常規(guī)途徑。近十多年來,各國學(xué)者對各種毒素的來源、類型、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及作用機制作了大量研究, 取得了可喜的進展。從目前的研究進展來看, 甲藻毒素在研究癌癥機理和開發(fā)抗癌、鎮(zhèn)痛、麻醉、抗病毒、抗菌等各種治療藥方面有著非常廣闊的應(yīng)用前景。此外, 甲藻毒素作為藥理研究工具藥的應(yīng)用前景也非常廣闊。

20世紀(jì)90年代之前C.monotis都被認(rèn)為是不產(chǎn)生毒素的, 然而 1995年澳大利亞科學(xué)家 Holmes等[15,16]發(fā)表的論文指出, 他們從澳大利亞海域分離出的C.monotis中發(fā)現(xiàn)一分子量為1062的鈉鹽具有毒性, 命名為Cooliatoxin。對小鼠進行腹腔注射,LD50為 1mg/kg, 中毒癥狀為先經(jīng)過一個未見中毒癥狀的延遲期, 然后出現(xiàn)體溫下降并且呼吸衰竭。然而這種中毒現(xiàn)象并未在當(dāng)時已證實的魚類毒素中發(fā)現(xiàn),可以認(rèn)為Cooliatoxin不會通過在魚體內(nèi)的積累而致人中毒。

Rhodes等[14,17-18]對C.monotis進行了一系列形態(tài)、毒性方面的研究。通過 FITC標(biāo)記血凝素檢驗(FITC-conjugated lectins)發(fā)現(xiàn)C.monotis能與Canavalia ensiformis和Helix pomatia結(jié)合, 但不能與Erythrina cristagalli結(jié)合, 推斷出C.monotis能產(chǎn)生 N-乙?；?D-半乳糖氨, 而不含α-乳糖。而與C.ensiformis的結(jié)合則可以證明其中含有甘露糖、葡萄糖、吡喃甘露糖中的一種或幾種。在鹵蟲(Artemia salina)的培養(yǎng)中加入C.monotis, 結(jié)果表明C.monotis能引起A.salina形態(tài)變異而非致死。他們進行的毒性實驗證實不同品系的C.monotis其提取物對小鼠的致死效力不同, 4個實驗品系中有一個在220 s使小鼠致死, 死亡征兆與一種叫做Rangaunu Harbour Toxin(RHT)的毒素致死征兆相似(此毒素在利瑪原甲藻Prorocentrum.lima中存在), 而其他 3個品系卻對小鼠無致死效力。另外, 實驗中C.monotis的提取物在成神經(jīng)細胞瘤(neuroblastoma)測定中能激活鈉離子通道。實驗所用的4個C. monotis品系中, 均未發(fā)現(xiàn)Holmes[16]報道的毒素Cooliatoxin。但Rhodes在實驗的 4個品系中的一個品系中發(fā)現(xiàn)有未知的聚醚類類似物, 另有一個品系的提取物具細胞毒性。他們的實驗還檢測出提取物有低水平的溶血活性, 但量太少還不足以確定是否是具溶血活性的沙海葵毒素(palytoxin, PTX)。

微藻常暴露在日照下受氧氣包圍, 但卻含有豐富的不飽和脂肪酸而不被氧化, 這個特性也引起了科學(xué)家們的興趣。20世紀(jì)90年代中期, 日本科學(xué)家Nakagawa, Murata等[19]試圖從C.monotis中尋找到能清除自由基的活性物質(zhì)。他們把C.monotis的提取物加入被氧化了的大鼠肺部微體脂肪, 以評估C.monotis所含化合物的抗氧化能力, 但實驗結(jié)果表明其提取物并未表現(xiàn)出很強的抗氧化能力。同時他們還用 P388小鼠白血病細胞進行篩選實驗, 加入Coolia monotis提取物以觀察存活率。在選用的4個C.monotis品系中, 兩個表現(xiàn)出了很強的毒性而另兩個的毒性則不很明顯。

對于C.monotis合成的化合物, Tanaka, Matsuoka等[20]用2D核磁、手性HPLC及CD的方法進行分析。在提取物中發(fā)現(xiàn)兩種化合物: 一種是新發(fā)現(xiàn)的化合物, 一種未知的神經(jīng)酰胺(圖1), 此神經(jīng)酰胺在當(dāng)時已發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物中是首次發(fā)現(xiàn) 18碳脂肪酸在 C15位上有甲基取代。另一個是海藻中常見的二酰基半乳糖甘油脂(diacylgalactosyl-glycerolipid, 圖2)。

2000年, Akasaka等[21]對上述的神經(jīng)酰胺進行了進一步的研究, 利用反向 HPLC等方法確定了此化合物手性中心的絕對構(gòu)像為R。

圖1 帶新穎支鏈的脂肪酸

圖2 二?；肴樘歉视王?/p>

2000年, 德國科學(xué)家Perovic等[22]在嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)和初級神經(jīng)元(Primary neuron)的培養(yǎng)中加入C.monotis離心后的上清液。結(jié)果未發(fā)現(xiàn)這兩種細胞有明顯死亡現(xiàn)象, 證明C.monotis對其不具有毒害作用, 不影響神經(jīng)細胞和突觸的自由鈣離子水平,對兩種細胞的生長發(fā)育也無明顯影響。

4 結(jié)語

C.monotis是分布范圍較廣的甲藻, 各國科學(xué)家對其進行了不同層次上的研究, 但由于在自然條件下,C.monotis數(shù)量通常較少, 在適宜生長季節(jié)一般也只占采樣所得甲藻數(shù)量的5%以下, 而且在甲藻中屬于較難培養(yǎng)種, 因而遠遠不能滿足科學(xué)研究和實際利用的需要。據(jù)1995年的統(tǒng)計, 世界范圍內(nèi)僅有包括澳大利亞、新西蘭等4個國家的5個實驗室分別存有C.monotis的9個培養(yǎng)株[23]。由于原材料較難獲得的制約, 目前國內(nèi)外對于C.monotis的研究相對較少, 國外僅有數(shù)量有限的幾篇報道, 對其次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、生物活性等方面的了解卻還尚未深入、知之甚少。國內(nèi)僅有對其形態(tài)及培養(yǎng)條件方面的研究, 尚未開展對其化合物方面進行探討的工作。

C.monotis在我國廣東、海南沿海均有分布, 中國科學(xué)院南海海洋研究所于1999年首次正式報道在南中國海發(fā)現(xiàn)C.monotis, 并且分離純化獲得藻株,并攻克了該種難保種難培養(yǎng)的瓶頸問題, 成為目前國內(nèi)唯一一家存有該藻種的單位。目前僅對其形態(tài)及培養(yǎng)條件進行了初步的研究, 尚未開展對其化合物成分及毒素成分進行探討的工作, 至于該南中國海地理品系是否為有毒種, 則需要通過一系列的試驗才能證實。因此, 深入研究C.monotis的生長特性、次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)、生物活性等, 對進一步開發(fā)利用海洋資源, 造福人類有著非常重要的科學(xué)意義和現(xiàn)實意義。

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Q178.53 文獻標(biāo)識碼: A 文章編號: 1000-3096(2012)01-0139-04

2010-09-12;

2010-12-10

中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程項目(KSCX2-YW-R-093); 廣東省科技攻關(guān)項目(2002A3050502)(2005B60301032)

梁計林(1981-), 男(壯族), 廣西柳州人, 博士, 工程師,專業(yè)為海洋調(diào)查與監(jiān)測, 電話: 0898-68966795, E-mail: jinn77@163.com; 龍麗娟, 通信作者, E-mail: longlj@scsio.ac.cn

張培新)