段維軍, 郭立新, 陳先鋒, 朱水芳, 朱文榮

(1. 寧波出入境檢驗檢疫局 技術中心, 浙江 寧波 315012; 2. 中國檢驗檢疫科學技術研究院 動植物檢疫研究所, 北京 100121; 3. 象山旭文海藻開發(fā)有限公司, 浙江 寧波 315040)

扁滸苔PCR快速檢測方法研究

段維軍1, 郭立新1, 陳先鋒1, 朱水芳2, 朱文榮3

(1. 寧波出入境檢驗檢疫局 技術中心, 浙江 寧波 315012; 2. 中國檢驗檢疫科學技術研究院 動植物檢疫研究所, 北京 100121; 3. 象山旭文海藻開發(fā)有限公司, 浙江 寧波 315040)

扁滸苔(Ulva compressa)能夠導致綠潮災害, 對其開展快速檢測技術研究是預防和控制其危害的重要技術手段。根據(jù)石莼屬不同種類核糖體基因轉錄間隔區(qū)域(ITS)的序列設計了一對檢測扁滸苔的特異性引物, 并對其反應條件和體系進行了優(yōu)化。PCR特異性檢測結果表明, 供試扁滸苔均擴增出與預期大小相一致的330 bp 產物, 而對緣管滸苔(Ulva linza)、滸苔(U. prolifera)、曲滸苔(U. flexuosae)、孔石莼(U. pertusa)的檢測結果全為陰性。PCR靈敏度試驗表明, 該PCR 體系最低可以檢測到10 pg 的扁滸苔DNA模板。本快速檢測方法為扁滸苔的早期識別與有效治理提供了科學依據(jù), 對相關扁滸苔產業(yè)和生態(tài)學等研究也具有一定參考意義。

扁滸苔(Ulva compressa); PCR; 檢測

石莼屬(Ulva), 也稱滸苔屬(Enteromorpha)[1], 隸屬于綠藻門(Chlorophyta), 綠藻綱(Chlorophyceae), 石莼目(Ulvales), 石莼科(Ulvaceae)。廣泛分布在世界范圍的海洋中, 有的分布在半咸水或江河中, 常生長在潮間帶巖石上或石沼中, 或泥沙灘的石礫上, 有時也可附生在大型海藻的藻體和船舶外殼之上[1-4]。中國江蘇、廣東、浙江、遼寧、福建、香港等沿海地區(qū)均有出產[5]。國外日本、菲律賓、馬來西亞、美國、印尼、澳大利亞、印度、新西蘭等地也有其生長記錄[4,6-11]。

扁滸苔(Ulva compressa)是石莼屬的一種。在東南亞地區(qū), 可以食用, 也可作藥用[12-14]。在生態(tài)學上,扁滸苔由于其富集重金屬的能力而作為重金屬污染指示生物[15]。此外, 扁滸苔等石莼屬綠藻也可以單獨或者共同造成綠潮災害[6,16-17]。

2007～2010年, 中國黃海海域連續(xù)發(fā)生石莼屬大型海藻異常繁殖生長形成的綠潮災害, 對當?shù)睾Ｑ笊鷳B(tài)系統(tǒng)、資源、環(huán)境與沿海經濟造成了不同程度的影響。據(jù)國家海洋局報告統(tǒng)計, 僅2008年由綠潮在黃海地區(qū)所造成的直接經濟損失即達 13.22億元[18]。作者研究表明, 此次綠潮由多種石莼屬混合造成, 其中就包括扁滸苔[19]。

綠潮藻種的快速準確鑒定是防控其危害的首要前提條件之一, 但是扁滸苔等石莼屬綠藻個體微小,生活形式多樣, 在綠潮爆發(fā)早期很難準確鑒定、檢測和監(jiān)測。對其開展快速檢測技術研究有助于綠潮預防、監(jiān)測、控制等工作的開展, 同時也可用于食品等扁滸苔相關產業(yè)有效成分識別和生態(tài)學方面的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試分離物

供試石莼屬綠藻采集于2009年, 均采用母藻細斷法[20]進行分離, 利用PES培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光暗周期為12 h/12 h, 光照強度為8000 lx, 培養(yǎng)溫度為20℃。供試分離物信息見表1。

1.1.2 儀器和試劑

PCR儀為 Biometra公司生產的 TProfessional Basic型、生物分光光度計為日本日立公司生產的U-0080D型、電泳設備和凝膠成像系統(tǒng)均購自伯樂(Biorad); Taq 酶、MgCl2、10×PCR buffer、100 bp DNA Ladder Marker、DNA片段純化試劑盒和凝膠純化試劑盒均購自寶生物(Takara); pGEM?-T Easy Vector systems II購自Promega; 實驗用引物由上海英俊合成; 其他試劑均為分析純。

表1 供試分離物Tab. 1 Isolates used in this study

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

參照 Coyer等[21]的方法并加以改進, 稱取0.1～0.2 g左右的單株藻體放入1.5 mL離心管中; 加少量 PVP, 滅菌石英砂和 200 μL 65 ℃水浴預熱的CTAB抽提液(2% CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris·HCl pH8.0), 研磨至勻漿;加入400 μL預熱CTAB抽提液, 顛倒混勻后于65 ℃水浴1 h; 冷卻至室溫后, 12 000 r/min離心10 min,取上清液至另一離心管中; 加入1/2 體積(300 μL)的Tris 飽和酚及 1/2 體積(300 μL)的氯仿：異戊醇(24：1), 顛倒混勻后靜置至其開始分層; 12 000 r/min離心10 min, 取上清液至另一離心管中; 加入等體積氯仿：異戊醇(24：1), 輕輕顛倒混勻; 12 000 r/min離心10 min,取上清液至另一離心管中; 向上清液中加入等體積異丙醇, 輕輕顛倒混合均勻后于－20 ℃沉淀1 h; 12 000 r/min離心10 min, 棄去上清液, 加500 μL 70%乙醇懸浮沉淀; 12 000 r/min離心5 min, 棄上清, 室溫干燥;加50 μL無菌水溶解沉淀, 采用石莼屬ITS通用引物進行擴增驗證后, －20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計

參照Hayden等[1]方法, 選用針對石莼屬ITS區(qū)的通用引物18S 1505和ENT 26S, 對供試材料基因組DNA進行擴增。經瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 使用DNA 片段純化試劑盒(Takara)和 pGEM?-T Easy Vector systems II(Promega)對 PCR產物進行回收純化和克隆, 菌液送上海英俊測序。

用MEGA 4.0軟件對測得的序列及從GenBank上獲得的石莼屬序列[U. araskii(AB097650)、U.armoricana(AB097661)、U. compressa(EU933981、EU933974、AB097641、AF035350)、U. fasciata(AY260567、AB097650、AB097650)、U. lactuca(AB097651)、U. linza(AY260557、AB097649、AB298633)、U. ohnoi(AB116031)、U. pertusa(AB097658、AY260568)、U. procera(AY422521)、U. prolifera(AB298312、AB298314、AJ234304、AY422510)、U. reticulate(AB097665)、U. rigida(AY422522)、U. scandinavica(AB097659)、U.spinulosa(AB097666)、U. taeniata(AY422525)]進行序列分析, 選擇扁滸苔 ITS區(qū)域中與其他種類有較大差異的區(qū)域, 根據(jù)引物設計的一般原則, 用Primer Premier 4.0軟件設計引物, 通過篩選最終確定一對引物。其中正向引物 Ucm6f序列為：5′-CGT TTT CGG AAC CGC CGG TGA-3′, 反向引物 Ucm2r序列為：5 ′-GGC CAG GTC CAC GGC CCG CTC T-3′。

1.2.3 PCR擴增反應的優(yōu)化

以 DNA提取步驟中獲得的扁滸苔分離物 QD3基因組 DNA為模板, 分別對 PCR反應條件中的溫度、時間及循環(huán)次數(shù)等以及PCR反應體系中的鎂離子濃度、dNTP濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物質量濃度進行優(yōu)化。反應體系的優(yōu)化試驗設計見表2。

PCR反應結束后點樣于 2%瓊脂糖凝膠中電泳,根據(jù)條帶的有無、以清晰程度和特異性來確定各影響因素的最終濃度。

1.2.4 PCR反應的特異性

采用優(yōu)化后的反應體系和條件對表1中供試分離物DNA進行PCR擴增, 以滅菌雙蒸水作為陰性對照。

1.2.5 PCR反應的靈敏度

用生物分光光度計測定扁滸苔分離物QD3基因組DNA的濃度, 并將其制備為25 μL反應體系中分別含有100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg核酸的PCR反應液。以上述5個不同濃度的扁滸苔基因組DNA為模板, 采用優(yōu)化后的PCR反應體系和條件進行擴增。

用 DNA凝膠回收試劑盒(Takara)純化回收特異性 PCR 產物, 將PCR產物克隆至pGEM?-T, 陽性克隆菌送上海英俊進行測序。

表2 PCR擴增反應體系的優(yōu)化Tab. 2 Optimization of PCR reaction

2 結果

2.1 DNA提取

采用石莼屬ITS通用引物[1]對提取DNA進行擴增的結果表明, 所有樣品均能有效進行擴增,且條帶清晰, CTAB法適合該類綠藻的 DNA提取。

2.2 PCR擴增反應的優(yōu)化

通過對PCR反應溫度、時間及循環(huán)次數(shù)等進行優(yōu)化, 最后確定 PCR 反應條件為：94 ℃, 預變性2 min; 94 ℃, 變性30 s, 60 ℃, 退火40 s, 72 ℃, 延伸 40 s, 34個循環(huán); 72 ℃, 延伸 10 min。25 μLPCR反應體系中各成分的最佳反應濃度為 Mg2+1.5 mmol/L, Taq DNA聚合酶1 U, dNTP0.2 mmol/L, 正反向引物各400 nmol/L。

2.3 PCR反應的特異性

采用設計的引物和優(yōu)化后的反應程序和體系,對表1中各分離物DNA進行PCR 擴增, 結果6份扁滸苔DNA樣品均出現(xiàn)一致的330 bp特異性條帶,而其他 DNA和陰性對照均未出現(xiàn)任何擴增條帶(圖1)。

2.4 PCR反應的靈敏度

扁滸苔 PCR反應靈敏度實驗結果見圖2。經過靈敏度試驗測定, 25 μL PCR反應體系最低能夠檢出10 pg扁滸苔DNA模板。

2.5 測序結果與序列分析

經測序與NCBI上序列Blast 比對分析, 證實了PCR 實際擴增產物與預期設計大小 330 bp 相符,DNA 序列與引物設計模板 ITS rDNA 基因對應片段的同源性為99%。

圖1 PCR特異性檢測實驗結果Fig. 1 The results of PCR specificity

圖2 PCR檢測DNA的靈敏度結果Fig. 2 Sensitivity of the PCR dectection

3 討論

石莼屬種內劃分的傳統(tǒng)方法是依據(jù)形態(tài)學特征進行分類, 由于石莼屬具有種類多、分布廣、形態(tài)特征復雜, 而且許多形態(tài)特征隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定的特點, 因此, 傳統(tǒng)的形態(tài)分類常引起分類系統(tǒng)的不穩(wěn)定或意見分歧, 難以準確鑒定石莼屬內種類[11,22]。如U.intestinalis通常沒有分枝, 而U.compressa有分枝, 但是低鹽或鹽休克可以誘導U.intestinalis形成分枝[22]。雜交測試法也是用來鑒定石莼屬海藻種類的另一種有效方法, 它通過一定技術手段獲得已知海藻與未知海藻釋放的配子, 進一步進行不同性別間配子的雜交實驗, 根據(jù)是否存在生殖隔離即能否雜交來判斷種類。該方法已在U.ohnoi、U.pertusa等石莼屬藻類得到了應用[6,19]。然而, 該方法從分離不同性別配子到進行雜交實驗,試驗周期較長。目前對于藻類的鑒定已經越來越多的借助于分子生物學的方法。近年來, ITS和Rubisco酶大亞基基因編碼序列(rbcL)序列在綠潮藻類及石莼屬藻種鑒定方面起了重要作用, 通過ITS、rbcL序列測定結合系統(tǒng)進化發(fā)育分析, 并綜合形態(tài)學觀察結果進行種類鑒定是目前國內外廣泛采用的一種石莼屬種類分析鑒定方法[23-25]。但是該方法試驗周期同樣較長, 且其準確性受分析所用序列、分析方法等多種因素影響。

近年來, 由石莼屬綠藻造成的綠潮在全球許多地區(qū), 特別是中國, 呈現(xiàn)高發(fā)、頻發(fā)態(tài)勢, 給當?shù)厣鷳B(tài)、旅游和農業(yè)生產帶來了巨大損失。對石莼屬綠藻的準確、快速鑒定和檢測是預防和控制該類生態(tài)問題的首要前提。然而, 由于石莼屬綠藻種類多樣、形態(tài)復雜、生活形式多樣, 對其進行準確鑒定和檢測具有較大難度[26]。為了準確鑒定食品工業(yè)中不同綠藻的種類, Rouxel等[27]采用SDS-PAGE對U. rotundata, U. rigida, U. compressa和U. intestinalis進行了檢測技術研究, 結果表明利用不同綠藻蛋白譜帶的差異可以區(qū)分這四種綠藻。但是, 結果準確性受蛋白提取過程、樣品數(shù)量和加工過程等多個因素影響, 因此 Rouxel等推薦使用 PCR方法來解決這一問題。PCR檢測反應通過一定技術手段分析特異性片段的有無, 能夠準確的鑒定所需要鑒定物種的種類, 是目前廣泛采用的一種技術手段, 已在多種有害藻檢測中得到了應用[28-29]。應用于石莼屬種內扁滸苔鑒定, 國內外尚未見相關研究報道。

選擇優(yōu)化的PCR反應條件和體系是特異性引物進行有效擴增的前提, 本試驗對溫度、時間、循環(huán)數(shù)等反應條件和Mg2+、Taq酶、dNTP、引物等反應體系進行了單因素優(yōu)化, 建立了優(yōu)化的 PCR反應條件和體系。在獲得樣品DNA條件下, 通過PCR反應和其產物凝膠電泳, 可以在3-4小時內對扁滸苔進行準確鑒定, 能夠實現(xiàn)快速檢測的目的。特異性試驗結果表明通過該方法能夠從供試 5種石莼屬綠藻中特異的檢測出扁滸苔, 而其他供試樣品均無特異性條帶的出現(xiàn)。本研究所使用扁滸苔樣品來源地有限, 雖然作者對浙江、福建等石莼屬綠藻較為常見地區(qū)進行了樣品采集, 但是并未獲得扁滸苔樣品, 這為進行不同地理來源的扁滸苔檢測實驗帶來了困難。同時由于未得到更多的石莼屬綠藻樣品, 無法對更多的石莼屬綠藻進行測試與驗證。然而通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索得到的序列進行比對和分析, 理論上該對引物具有較好的特異性。靈敏度實驗表明最低能夠檢出10 pg的扁滸苔DNA模板, 只需要少量海藻樣品即可檢出。本試驗建立的快速、特異、靈敏的檢測鑒定扁滸苔的 PCR反應體系和條件, 對于在綠潮爆發(fā)初期提供準確的鑒定結果, 相應的采取防控措施具有重要意義。同時, 本研究所建立的方法也可用于相關的生態(tài)學研究和食品等行業(yè)的相關研究。

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Rapid detection ofUlva compressaby PCR

DUAN Wei-jun1, GUO Li-xin1, CHEN Xian-feng1, ZHU Shui-fang2, ZHU Wen-rong3
(1. Ningbo Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau Technical Center, Zhejiang Province, Ningbo 315012,China; 2. Institute of Animal and Plant Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100121,China; 3. Xiangshan Xuwen development of Seaweed CO.,ltd, Zhejiang Province, Ningbo 315040, China)

Apr., 23, 2011

Ulva compressa; PCR; detection

Ulva compressais one of causal agent for green tide. Rapid detection ofU. compressais important to prevent and control green tide. In this study, a pair of primers was designed for PCR diction ofU. compressaaccording to the differential region of ITS rDNA ofUlvasp．The protocols for PCR amplification was optimized. The PCR detection can differentiateU. compressafrom otherUlvaalgaes, includingU. linza,U. prolifera,U. flexuosae,andU. pertusa. The detection sensitivity was 10 pg of algae genome DNA per PCR reaction. The specific PCR can be applied to rapid detection ofU. compressa.

Q789 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)01-0030-06

2011-04-23;

2011-06-29

中國檢驗檢疫科學技術研究院基本科研業(yè)務費專項資金資助項目(2009JK002); 國家質檢總局科研項目(2011IK181); 浙江省重點科技創(chuàng)新團隊項目(2010R50029)

段維軍(1977-), 男, 博士, 從事有害生物識別與檢測技術研究, E-mail：weijunduan@yahoo.com.cn; 朱水芳, 通信作者, E-mail：zhushf@netchina.com.cn

梁德海)