逄 越, 李慶偉

(1. 遼寧師范大學 生命科學學院, 遼寧 大連 116029; 2. 大連大學 生命科學與技術學院, 遼寧 大連 116622)

日本七鰓鰻外周血細胞顯微結構及類淋巴細胞體外培養(yǎng)

逄 越1,2, 李慶偉1

(1. 遼寧師范大學 生命科學學院, 遼寧 大連 116029; 2. 大連大學 生命科學與技術學院, 遼寧 大連 116622)

以日本七鰓鰻(Lampetra japonica)為研究對象, 觀察其外周血細胞顯微結構和探討類淋巴細胞原代培養(yǎng)條件。采用Wright氏和Giemsa氏染色法對日本七鰓鰻外周血液有形成分進行顯微觀察, 可鑒別出紅細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞; 未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細胞。通過 Ficoll密度梯度離心法和流式細胞儀分選獲得高純度的七鰓鰻類淋巴細胞。經(jīng)條件優(yōu)化后確定最適培養(yǎng)液L15 + 20% FBS(5%七鰓鰻血清)+ 0.46% NaCl, 在18℃, pH 6.8～7.0的條件下對日本七鰓鰻類淋巴細胞進行體外培養(yǎng), 大多數(shù)類淋巴細胞半貼壁生長, 細胞狀態(tài)較好, 最長可以存活近一個月。類淋巴細胞的原代培養(yǎng)為日本七鰓鰻細胞體外培養(yǎng)的深入研究提供了實驗依據(jù)。

日本七鰓鰻(Lampetra japonica); 血細胞; 類淋巴細胞; 細胞培養(yǎng)

日本七鰓鰻(Lampetra japonica)屬無頜類脊椎動物, 是現(xiàn)存最古老的脊椎動物代表。由于七鰓鰻是聯(lián)系無脊椎動物與脊椎動物之間的重要階元, 因此在遺傳信息方面, 它必定印記了無脊椎動物的進化歷史, 同時作為脊椎動物最直接的祖先, 又為脊椎動物的起源與進化提供豐富的遺傳信息。2009年美國冷泉港實驗室[1]提出將七鰓鰻作為進化和發(fā)育生物學研究的模式生物。七鰓鰻不僅是研究脊椎動物起源與進化的關鍵物種, 且它所具有的特殊生活方式,又賦予它諸多特有的功能基因, 特別是在脊椎動物適應性免疫應答的起源與進化等方面具有極為重要的意義。

20世紀 80年代初期 Fujii等[2]首次發(fā)現(xiàn)七鰓鰻血液內具有形態(tài)上相似于有頜類脊椎動物淋巴細胞的一類細胞。中國學者文興豪等[3]于1998年對日本七鰓鰻的血細胞進行了顯微及亞顯微結構觀察, 證實其存在淋巴細胞。2000年Shintani等[4]在七鰓鰻的腸壁組織中發(fā)現(xiàn)PU.1/ Spi-B同源基因的表達, PU.1/Spi-B基因是高等脊椎動物淋巴細胞中特異表達的一類蛋白基因家族, 該研究在分子水平上進一步驗證了無頜類脊椎動物存在淋巴細胞。2002年, Mayer等[5]在海七鰓鰻(Petromyzon marinus)的前腸組織中,分離出一種類似于淋巴細胞的一類細胞, 其體積比哺乳動物的淋巴細胞略小, 有一個濃縮染色質的細胞核, 胞質中有相應的細胞器, 將其稱為類淋巴細胞(lymphocyte-like cells)。于岑杰等[6]在2007年對日本七鰓鰻外周血通過 Ficoll密度梯度離心和流式細胞分選獲得類淋巴細胞。2009年, Cooper等[7]提出七鰓鰻具有VLRA和VLRB兩類淋巴細胞群, 功能上分別類似哺乳動物適應性免疫系統(tǒng)中分泌細胞因子的T細胞及分泌抗體的B細胞。作為重要的免疫細胞,七鰓鰻類淋巴 細胞的存在, 是研究其適應性免疫進化的基礎。為此, 作者在原有工作的基礎上, 探索七鰓鰻類淋巴細胞原代培養(yǎng)方法, 優(yōu)化培養(yǎng)條件,從而為七鰓鰻體外細胞培養(yǎng)及建立細胞株提供基礎,為今后開展七鰓鰻相關研究工作提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

日本七鰓鰻2009年12月末采自黑龍江省松花江流域同江地區(qū)。選取健康、體表完整的個體, 觀察7 d, 證實無病后用于實驗。

1.1.2 試劑

淋巴細胞分離液(比重 1.092)購自天津灝洋生物公司; Leibovitz’s L15基礎培養(yǎng)液購自 Sigma公司;RPMI 1640、M199 及高糖 Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)基礎培養(yǎng)液購自Hyclone 公司, 特級胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)為 Invitrogen Gibco原裝進口, 鼠尾膠原蛋白Ⅰ型購自杭州生友生物技術有限公司, 多聚賴氨酸(Poly-D-lysine)購自碧云天生物技術研究所; 臺盼藍、瑞氏(Wright)氏和姬姆薩(Giemsa)氏染液為實驗室保存。

1.1.3 試劑配制

1.1.3.1 配置培養(yǎng)液

按照實驗設計在基礎培養(yǎng)液中分別加入體積分數(shù)為5 %、10 %、20 %的特級胎牛血清, 其中含100 U/ mL青霉素、100 mg/ L鏈霉素。

1.1.3.2 七鰓鰻血清

從尾動脈中采取外周血, 室溫放置1 h后, 4 ℃過夜, 次日, 5 000 r/min離心20 min取上清, 即為血清, 將血清在 56℃水浴滅活 30 min, 過濾除菌后分裝, 置于-20℃?zhèn)溆?。?5 g/L鼠尾膠原蛋白Ⅰ型溶解于 0.006 mol/L乙酸中, 使其終濃度為 0.012 g/L,按2 μg/cm2包被培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板。將5 g/L多聚賴氨酸配制濃度為 0.1 g/L的工作液包被培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板。培養(yǎng)液、平衡鹽溶液及使用的器械經(jīng)嚴格的滅菌消毒, 所有的培養(yǎng)液及平衡鹽溶液pH值調為6.8～7.0。

1.2 方法

1.2.1 血涂片觀察日本七鰓鰻外周血細胞的形態(tài)特征

無菌條件下剪斷尾巴, 取一滴血, 滴于潔凈的載玻片, 制備血涂片。將制好的血涂片自然晾干, 然后將載玻片放入含有甲醇的染缸中固定 10 min, 再放入含有Giemsa氏染液或Wright氏染液的染缸中染色45 min, 用蒸餾水沖洗, 干燥, 即可鏡檢。

1.2.2 外周血類淋巴細胞的分離

將日本七鰓鰻置2%次氯酸鈉中10 min, 再移入70%乙醇中浸泡15 min 進行體表消毒, 用滅菌雙蒸水洗滌 3次, 將七鰓鰻置無菌紗布上吸干體表水分,無菌條件下剪斷尾巴, 外周血液滴入2 mL的抗凝管中, 加 2倍體積 Hank’s液稀釋。取比重為 1.092的小鼠淋巴細胞分離液3 mL置于離心管中, 用移液器吸取稀釋血液3 mL, 沿管壁緩緩的加入到淋巴細胞分離液界面上, 水平轉頭離心 20 min (20℃, 1200 r/min)。待離心后溶液出現(xiàn)四層界面, 中間白膜狀層是白細胞層, 吸取中間白膜狀單個核細胞層重復上述過程。最終經(jīng)3 000 r/min離心5 min收集白細胞。利用流式細胞儀對分離到的白細胞進行分選, 根據(jù)細胞的前向光及側向光散射特征成功分選出類淋巴細胞, 分選效率高達95%。

1.2.3 細胞計數(shù)

取類淋巴細胞懸液 0.5 mL與 0.4%臺盼藍染液0.5 mL于離心管中混合均勻, 吸取少許混合液加入到血球計數(shù)板上, 顯微鏡下計數(shù) 4個大方格內的細胞總數(shù)/4×104×(稀釋倍數(shù))進行計算。同時進行細胞活力檢測。按公式活細胞百分率=活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%, 計數(shù)200個類淋巴細胞, 并計算出活細胞的百分率。當細胞培養(yǎng)兩周后, 對現(xiàn)存活細胞計數(shù), 計算細胞存活率(存活率=現(xiàn)存活細胞數(shù)/培養(yǎng)時活細胞總數(shù)×100%)。

1.2.4 細胞培養(yǎng)條件

1.2.4.1 不同培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)

以L15、高糖DMEM、M199、RPMI 1640為基礎培養(yǎng)液, 各加入20%FBS配制細胞培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下觀察日本七鰓鰻類淋巴細胞在不同培養(yǎng)液中細胞生長狀況, 并計數(shù)細胞貼壁率和存活率(6次重復實驗數(shù)據(jù))。

1.2.4.2 不同血清濃度的細胞培養(yǎng)

在L15培養(yǎng)液中分別加入體積分數(shù)為5%、10%、20%的特級胎牛血清以及 5%滅活的七鰓鰻血清, 配制細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)日本七鰓鰻類淋巴細胞, 觀察其生長情況。

1.2.4.3 不同生長基質的細胞培養(yǎng)

以裸的玻璃培養(yǎng)瓶為對照, 用鼠尾膠原、0.01%多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶及一次性塑料培養(yǎng)瓶, 對類淋巴細胞進行培養(yǎng), 觀察其生長情況。

1.2.4.4 不同溫度的細胞培養(yǎng)

以4、18、26、37℃為培養(yǎng)溫度對日本七鰓鰻類淋巴細胞培養(yǎng), 觀察其生長情況。

2 結果

2.1 日本七鰓鰻外周血細胞的顯微結構

將日本七鰓鰻外周血涂片置于光學顯微鏡下觀察。橢圓形的紅細胞占絕大多數(shù), 少數(shù)單個或三五成群的白細胞分散于密集的紅細胞之間, 見圖1。

紅細胞：紅細胞呈橢圓形, 表面光滑, 核橢圓形,位于細胞中央。核內含有致密染色質團塊, 染成深紫紅色。胞質內充滿血紅蛋白, 染成均勻的淺紫紅色(圖1-1a)。

中性粒細胞(neutrophil)：細胞形態(tài)呈圓形、卵圓形、橢圓形、近似長方形或不規(guī)則形狀。核較大, 形狀多樣, 呈分葉狀(圖1-1b, 1-2b, 1-3b)和桿狀(1-4c),分葉居多一般為 2-3葉。胞質豐富, 染成淺粉紅色,其中充滿小顆粒。

淋巴細胞：在血涂片上個體較小的一類細胞。細胞呈圓形或不規(guī)則圓形。核圓形, 所占比例大, 位于細胞中央, 核中染色質濃密, 染成藍紫色。胞質呈一薄層圍于核外(圖1-2d, 1-3d)。

單核細胞：細胞圓形、卵圓形或橢圓形。核卵圓形或腎形, 多偏于一側, 也有位于中央位或略偏于中央位。染色質疏網(wǎng)狀, 染成紫紅色。胞質較豐富,染成藍色, 近核膜處較淡, 胞質中有許多大小不等的空泡, 空泡間有藍紫色顆粒散布。小的單核細胞與較大的淋巴細胞形態(tài)結構較相似, 但前者一般體積較大, 而核質比例較小, 胞質更豐富且著色更深, 核的形狀也較不規(guī)則(圖1-3e, 1-5e, 1-6e)。

嗜酸性粒細胞：細胞圓形, 核圓形偏于一側, 染成紫紅色。胞質染成淺粉紅色, 胞質中嗜酸性顆粒較粗大, 染成紫紅色, 近細胞膜處分布較多, 在七鰓鰻的血涂片中不多見(圖1-3f)。

圖1 日本七鰓鰻外周血細胞的顯微圖像(×400)Fig. 1 Microscopic structures of the lamprey peripheral blood cells

2.2 不同培養(yǎng)液對日本七鰓鰻類淋巴細胞生長的影響

采用 L15、高糖 DMEM、M199、RPMI1640為基礎培養(yǎng)液, 分別加入20%FBS制成基礎培養(yǎng)液, 對七鰓鰻類淋巴細胞進行培養(yǎng), 細胞培養(yǎng)初期各種培養(yǎng)基對細胞狀態(tài)影響不大, 但培養(yǎng) 1個月時觀察發(fā)現(xiàn), L15和RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞效果明顯優(yōu)于M199和高糖DMEM培養(yǎng)液, 其中加入20%FBS 和0.46%NaCl的 L15培養(yǎng)液為七鰓鰻類淋巴細胞較為理想的培養(yǎng)液, 說明 L15培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分比較適合七鰓鰻類淋巴細胞的生長, 有利于細胞黏附、鋪展和生長繁殖。實驗結果見表1。

2.3 不同濃度的血清對日本七鰓鰻類淋巴細胞生長的影響

在 L15基礎培養(yǎng)液中加入不同濃度的新生牛血清和七鰓鰻血清, 以鼠尾膠原為基質的 6孔培養(yǎng)板中進行細胞培養(yǎng)觀察1個月, 實驗結果見表2。培養(yǎng)液中加入20%特級胎牛血清或加入5%七鰓鰻血清都能使細胞在很短的時間內貼壁, 細胞生長狀態(tài)優(yōu)于含有5%和10%FBS的培養(yǎng)液, 這表明胎牛血清含量對于類淋巴細胞的生長狀態(tài)呈劑量依賴關系, 此試驗也說明用胎牛血清替代七鰓鰻自身血清, 對細胞培養(yǎng)能達到同樣良好效果。

2.4 不同的生長基質對日本七鰓鰻類淋巴細胞生長的影響

采用L15 + 20 %FBS + 0.46 %NaCl細胞培養(yǎng)液,在不同的生長基質上培養(yǎng)類淋巴細胞, 體外培養(yǎng)一個月實驗結果見表3。用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板比用鼠尾膠原包被的培養(yǎng)板培養(yǎng)的細胞更易貼壁, 但就細胞生長狀態(tài)來說, 鼠尾膠原對細胞無毒害作用,所以其包被的培養(yǎng)板更有利于細胞長期良好的生長。

表1 不同培養(yǎng)液對日本七鰓鰻類淋巴細胞生長的影響Tab. 1 Effect of medium on primary cell culture of lamprey lymphocyte-like cells

表2 不同血清濃度對日本七鰓鰻類淋巴細胞生長的影響Tab. 2 Effect of serum on primary cell culture of lamprey lymphocyte-like cells

表3 不同生長基質對日本七鰓鰻類淋巴細胞生長的影響Tab. 3 Effect of substrates on primary cell culture of lamprey lymphocyte-like cells

2.5 不同溫度對日本七鰓鰻類淋巴細胞生長的影響

采用L15 + 20 %FBS + 0.46 %NaCl細胞培養(yǎng)液,以鼠尾膠原作為生長基質, 在不同溫度條件下培養(yǎng)日本七鰓鰻類淋巴細胞7 d, 實驗結果見表4。七鰓鰻類淋巴細胞在18℃生長狀態(tài)最佳, 4℃條件下活細胞數(shù)量比接種前減少一半, 而 37℃條件下培養(yǎng)的細胞形態(tài)較差, 一周后細胞全部死亡。

2.6 日本七鰓鰻類淋巴細胞生長形態(tài)學觀察

用L15 + 20 %FBS + 0.46 %NaCl為基礎培養(yǎng)液對日本七鰓鰻類淋巴細胞原代培養(yǎng), 同時將七鰓鰻紅細胞和白細胞分別培養(yǎng)作對照, 實驗結果見圖2。白細胞種類多樣, 包括單核細胞, 淋巴細胞, 粒細胞等(圖2-1)。紅細胞多呈圓形或橢圓形, 表面光滑, 有細胞核, 核呈橢圓形, 位于細胞中央(圖2-2)。而經(jīng)流式細胞分選儀分選后細胞種類趨于單一, 細胞形態(tài)為圓形和橢圓形, 一開始接種細胞可見細胞游離在培養(yǎng)基中, 約1 h后細胞大部分貼壁, 這些貼壁細胞并不重疊, 而是依次排開, 形成單層細胞, 貼壁細胞密度與細胞開始接種量有關, 接種量小, 細胞分散貼壁, 接種量大, 形成單層密集。細胞整體透明, 周邊輪廓較淡, 細胞顆粒較少。七鰓鰻類淋巴細胞生長周期慢, 約間隔3或4 d換1次培養(yǎng)液(圖2-3), 在培養(yǎng)1個月后, 細胞數(shù)量逐漸減少, 細胞膜發(fā)暗, 細胞內顆粒增多, 有半數(shù)細胞懸浮, 但細胞聚集團塊周圍細胞數(shù)目增多, 伴有新生細胞出現(xiàn), 細胞透明, 有望繼續(xù)傳代培養(yǎng)(圖2-4)。

表4 不同溫度對日本七鰓鰻類淋巴細胞生長的影響Tab. 4 Effect of temperature on primary cell culture of lamprey lymphocyte-like cells

圖2 日本七鰓鰻白細胞、紅細胞和類淋巴細胞的原代培養(yǎng)(×400)Fig. 2 Primary culture of lamprey leucocyte、erythrocyte and lymphocyte-like cells in vitro

3 討論

日本七鰓鰻外周血涂片的有形成分中紅細胞占絕大多數(shù), 細胞是有核的圓形或橢圓形, 體積比哺乳類的紅細胞大[8-9], 與魚類的相接近[10-11]。七鰓鰻外周血的白細胞中淋巴細胞所占比例最大, 它的顯微結構與其他魚類及哺乳動物無明顯差異, 大小之間也無絕對的分界。眾所周知, 單核細胞存在于所有脊椎動物中, 擔負著非特異性免疫和抗原提呈重要作用, 七鰓鰻外周血中單核細胞形態(tài)比紅細胞稍小,與魚類單核細胞一樣有較多的胞質突起, 胞質中含有較多的液泡和吞噬物, 它進行活躍的變形運動,具有黏附和較強的吞噬能力。粒細胞包括嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞。中性粒細胞較多, 偶爾可見嗜酸性粒細胞, 未見到嗜堿性粒細胞的存在, 這與鰻鱺(Anguilla japonica)[12]、鱖魚(Siniperca chuatsi)[13]、大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)[14]、日本白鯽(Carassius auratus cuvieri)[15]、海鰻(Muraenesax cinereius)[16]、淡水石斑(Cichlasoma managuense)[17]相同。魚類嗜中性粒細胞具有吞噬和殺傷機能, 能做變形運動[18], 參與機體的炎癥反應[19]。日本七鰓鰻各類血細胞的大小與其他魚類基本一致, 細胞種類和形態(tài)特征與以前文獻報道基本相近[3]。

目前分離魚類白細胞較多采用標準 Ficoll密度梯度離心法和 Percoll-Paque法, 這兩種方法操作簡單且可獲得大量淋巴細胞, 而Ficoll法是分離動物全血中單個核細胞的常用技術, 但分離不同種屬動物的單個核細胞使用分離液的比重有所不同。本實驗室經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)比重為 1.092的分離液可有效分離日本七鰓鰻外周血單個核細胞, 分離的細胞數(shù)量大且純度高, 可以滿足進一步研究的需要。雖然細胞分離液的比重是影響類淋巴細胞分離的關鍵因素,但其他影響因素也較多, 如外周血液用量、離心力大小與時間、七鰓鰻個體差異及血液黏稠度等都會影響分離的類淋巴細胞數(shù)量和純度[20]。另外, 因分離的類淋巴細胞還用于體外培養(yǎng), 所以整個操作過程和使用的試劑、器皿均需嚴格消毒滅菌。鑒于上述影響因素, 經(jīng)過多次實驗探索, 作者實驗室已經(jīng)確立了從日本七鰓鰻外周血中分離類淋巴細胞的一套最佳實驗方案。

哺乳動物的淋巴細胞培養(yǎng)已成為臨床檢驗和免疫學研究的基本技術, 而七鰓鰻這個原始脊椎動物的代表其類淋巴細胞的培養(yǎng)還未見報道。要想體外培養(yǎng)七鰓鰻細胞首先要了解它的生活習性, 日本七鰓鰻是洄游性種類, 幼鰻在江河中生活 3～4 年,成體后進入海中生活, 秋季由?；氐浇? 在江河下游越冬, 翌年 5～6月份, 當水溫達 15℃左右時溯至上游繁殖。因此掌握日本七鰓鰻的滲透壓值是至關重要的。早在1933年Galloway[21]指出淡水七鰓鰻血液最適生理鹽水濃度為0.46%。而作者捕撈的日本七鰓鰻是從日本海洄游進入江河, 因此本試驗采用淡水七鰓鰻血液最適生理鹽水濃度值 0.46%NaCl來調節(jié)細胞滲透壓, 已獲得良好的細胞生長狀態(tài)。本試驗還發(fā)現(xiàn)用5%滅活的七鰓鰻血清代替20%胎牛血清,同樣能使細胞貼壁和生長, 細胞狀態(tài)基本一致。資料顯示脊椎動物細胞培養(yǎng)基的適宜 pH值為 7.2～7.4,而蝦細胞培養(yǎng)基的pH值為6.8～7.2[22], pH值過高或過低時, 使細胞生長顯著下降, 同樣pH值對日本七鰓鰻類淋巴細胞的培養(yǎng)也有顯著影響。經(jīng)過長期試驗確定了七鰓鰻類淋巴細胞體外培養(yǎng)的最佳條件,L15 + 20%FBS(或5%七鰓鰻血清)+ 0.46%NaCl為培養(yǎng)液, 以膠原蛋白為生長基質, 最佳 pH 在 6.8～7.0,最佳培養(yǎng)溫度在18℃, 需要5%CO2培養(yǎng)箱。本實驗所采用的培養(yǎng)條件較適合七鰓鰻類淋巴細胞生長,得到了較好的培養(yǎng)效果, 從而為七鰓鰻體外類淋巴細胞培養(yǎng)、建株及開展有關七鰓鰻體外細胞培養(yǎng)水平的實驗研究奠定良好基礎。

眾所周知, PHA和ConA為T細胞有絲分裂原、LPS為 B細胞有絲分裂原, 這些有絲分裂原可促進體外培養(yǎng)的淋巴細胞增殖和分化。但將這些有絲分裂原加入到細胞培養(yǎng)液中, 對七鰓鰻類淋巴細胞的增殖和分化沒有太大影響, 分析原因可能在日本七鰓鰻的類淋巴細胞中尚未分化出哺乳動物中具有的T、B淋巴細胞兩大類群。本實驗室用PHA、ConA、LPS對七鰓鰻魚腹腔免疫, 用淋巴細胞分離液分離外周血獲得白細胞數(shù)量明顯增多, 而這些有絲分裂原對體外培養(yǎng)的類淋巴細胞卻無顯著變化, 其中緣由有待于進一步研究探討。

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Microscopic structures of Japanese lamprey peripheral blood cells and culture of lymphocyte-like cells in vitro

PANG Yue1,2, LI Qing-wei1
(1. School of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 2. College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China)

Oct., 5, 2010

Japanese lamprey; haemocyte; lymphocyte-like cells; cell culture

The microstructure of Japanese lamprey (Lampetra japonica) peripheral blood cells and the cultivation methods of lymphocyte-like cells were explored. The peripheral blood cells ofL. japonicawere stained by Wright’s and Giemsa’s staining methods and five major cell types including erythrocyte, lymphocyte, neutrophil granulocyte,monocyte and eosinophil granulocyte, but not basophil were recognized under light microscope. The lymphocyte-like cells were separated successfully with Ficoll-Paque centrifugation and flow cytometry and were cultured in L15 medium with 20% foetal bovine serum (FBS) including 5%L. japonicaFBS and 0.46% NaCl. The optimal temperature of cells is 18℃ and the optimal pH of cells is 6.8-7.0. They can develop attachment as a sheet of cells after 1 hour. Cells have a good condition for nearly a month. The establishment of primary cell cultures of lymphocyte-like cells fromL. japonicaprovides a useful tool for the longevity of the culture and the investigation in cellular biology.

Q952, Q253 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)01-0023-07

2010-10-05;

2011-03-10

國家自然科學基金資助項目(31071991, 31140002); 大連市科技計劃項目(2011J21DW016)

逄越(1975-), 女, 遼寧大連人, 講師, 博士在讀, 主要從事海洋功能基因研究, 電話：0411-87402327, E-mail：pangyue01@163.com;李慶偉, 通信作者, 電話：0411-85827799, E-mail：liqw@263.net

譚雪靜)