王 偉，李 覃，李 瑛，李 輝

白藜蘆醇抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及影響miR－34a表達(dá)的研究

王 偉1，李 覃2，李 瑛1，李 輝1

目的觀察白藜蘆醇(resveratrol，Res)對(duì)人膀胱癌細(xì)胞T24生長(zhǎng)增殖的影響，初步探討miR－34a在Res影響T24細(xì)胞中的作用。方法不同濃度Res分別作用T24細(xì)胞24 h，采用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blotting檢測(cè)p53蛋白水平，實(shí)時(shí)定量PCR(Real－time PCR)檢測(cè)T24細(xì)胞miR－34a的基因表達(dá)。結(jié)果Res劑量依賴性地抑制T24細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，明顯增加p53的蛋白表達(dá)。此外，Res處理后T24細(xì)胞中miR－34a的基因表達(dá)亦顯著升高。結(jié)論Res能夠有效抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、上調(diào)miR－34a及p53表達(dá)有關(guān)。

白藜蘆醇;膀胱癌;細(xì)胞凋亡;miR－34a;p53

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是非黃酮類多酚化合物，具有抗腫瘤、抗感染、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等多種生物學(xué)活性［1］。自從 Jung等［2］首次在Science雜志對(duì)Res在腫瘤發(fā)生、發(fā)展各階段的抑制作用進(jìn)行了系統(tǒng)報(bào)道之后，Res便成為腫瘤防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并被認(rèn)為是最具有希望的天然化學(xué)防癌劑之一，但其具體作用機(jī)制因細(xì)胞種類不同而異［3］。

微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一類由基因組編碼的單鏈小分子RNA。新近研究顯示，miRNA的表達(dá)水平在人類膀胱癌組織與正常膀胱組織間具有明顯差異，與膀胱癌的生物學(xué)特性存在密切關(guān)系，有望成為膀胱癌生物治療的新靶點(diǎn)［4］。本研究選用人膀胱癌T24細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)觀察Res對(duì)T24細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響，初步探討miRNA－34a在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌T24細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)泌尿研究所惠贈(zèng)，Res(純度99.12%)購(gòu)于陜西賽德生物股份有限公司，RPMI1640、胎牛血清(FCS)購(gòu)自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)、MTT購(gòu)自Sigma公司，Annexin V－PI Staining試劑盒購(gòu)于BD公司，Real－time PCR相關(guān)試劑購(gòu)自Promega公司。

1.2 試劑配制 Res溶于DMSO成1 mmol/L，濾過(guò)除菌，－20℃貯存。體外實(shí)驗(yàn)時(shí)以RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度(DMSO終濃度不高于0.1%)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及增殖分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膀胱癌T24 細(xì)胞，以 6.25、12.5、25、50、100 μmol/L Res 分別作用24 h。另設(shè)不加Res的T24細(xì)胞為對(duì)照組，同時(shí)設(shè)不含細(xì)胞和不做任何處理的空白對(duì)照消除背景干擾，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加入5 mg/ml MTT 20 μl，再培養(yǎng)4 h，離心 1000 r/min，5 min 后小心吸去上清，加入DMSO溶解沉淀，490 nm處測(cè)定光吸收度(A值)，計(jì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 Annexin－V法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 以終濃度為100 μmol/L的Res處理T24細(xì)胞24 h，按照試劑盒說(shuō)明分別用FITC標(biāo)記的Annexin－V和PI染色細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)上分析熒光強(qiáng)度，定量檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western blot 以100 μmol/L Res作用 T24細(xì)胞24 h，裂解細(xì)胞后經(jīng)Bio－Rad法進(jìn)行蛋白定量，12%SDS－PAGE凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜，一抗為 p53(1∶1000)，以 β －actin(1∶1000)作為內(nèi)參照。ECL法檢測(cè)，采用BioRad系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.6 Real－time PCR 首先根據(jù)miRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物。提取總RNA，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在BioRad CFX96定量PCR儀上進(jìn)行定量檢測(cè)。PCR條件為94℃ 2 min，94℃15 s，60℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);采用U6 RNA作為內(nèi)標(biāo)。樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)率(RQ)采用△△CT方法計(jì)算，RQ=2－△△CT，以未處理的 T24細(xì)胞作為相對(duì)表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用多因素重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析或單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Res抑制膀胱癌T24細(xì)胞生長(zhǎng)增殖 對(duì)照組T24細(xì)胞增殖明顯，Res處理組對(duì)T24細(xì)胞的增殖抑制作用呈一定的劑量依賴性，其中6.25、12.5、25、50、100 μmol/L 濃度的抑制率分別為(21.25 ±3.67)%、(25.89±6.26)%、(38.17±2.25)%、(43.28±4.34)%、(53.26±4.52)%，與 6.25 μmol/L 組比較，25、50、100 μmol/L 組的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。24 h的 IC50為(85.68± 4.62)μmol/L。

2.2 Res誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，100 μmol/L Res作用 24 h后可見(jiàn)(39.26±6.86)%的T24細(xì)胞發(fā)生凋亡，說(shuō)明Res能夠以誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的方式殺傷T24細(xì)胞。

2.3 Res對(duì)T24細(xì)胞p53蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，Res能夠明顯增加p53蛋白的表達(dá)水平(圖1)。

圖1 白藜蘆醇影響p53的蛋白表達(dá)

2.4 Res上調(diào)miR－34a的基因表達(dá) Real－time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Res處理組和未處理組均有miR－34a和U6的特異性條帶，miR－34a與U6均顯示出可靠的CT值。100 μmol/L Res作用24 h后miR－34a表達(dá)明顯升高，是未處理組的4.1倍。

3 討 論

膀胱腫瘤是我國(guó)最常見(jiàn)的泌尿系惡性腫瘤，局部治療后容易復(fù)發(fā)，且缺乏理想的腫瘤標(biāo)記物［5］。目前常用的化療藥物對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞殺傷作用缺乏靶向性，且不良反應(yīng)大。研究表明，有600多種中草藥具有不同程度的殺傷癌細(xì)胞的作用，由于不良反應(yīng)小，能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，降低化療不良反應(yīng)，減少?gòu)?fù)發(fā)等特點(diǎn)而備受各國(guó)研究人員的關(guān)注。Res作為傳統(tǒng)中藥虎杖的主要有效成分，基本不造成器官和功能損害，在腫瘤的化學(xué)治療和化學(xué)預(yù)防方面具有良好的應(yīng)用前景［6］。盡管對(duì)Res的抗腫瘤研究已經(jīng)取得許多進(jìn)展，但是目前對(duì)Res影響膀胱癌的具體作用機(jī)制和干預(yù)靶點(diǎn)尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)觀察到，膀胱癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度Res作用后，生長(zhǎng)增殖明顯受抑，細(xì)胞凋亡增加，說(shuō)明Res能夠有效抑制膀胱癌細(xì)胞，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

p53蛋白在DNA損傷后表達(dá)，可啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，如修復(fù)失敗或發(fā)生廣泛DNA損傷，則P53激活凋亡通路?，F(xiàn)已證實(shí)，p53突變是評(píng)估膀胱癌發(fā)生的重要機(jī)制，在高分期、分級(jí)的膀胱癌中頻繁表達(dá)，在膀胱癌的進(jìn)展、預(yù)后及治療中都起著非常重要的作用。筆者研究發(fā)現(xiàn)，Res處理后，膀胱癌T24細(xì)胞p53蛋白表達(dá)顯著增加，提示上調(diào)p53可能是Res誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所致DNA損傷的繼發(fā)性改變，進(jìn)而增強(qiáng)Res的促凋亡效應(yīng)。

miRNA在腫瘤的增殖、分化和凋亡等生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中miR－34家族(主要包括miR－34a，miR－34b和miR－34c)與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，能夠誘發(fā)Caspase調(diào)控的凋亡途徑［7］;或通過(guò)抑制 Bcl－ 2 促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。此外，亦有研究表明，p53可作為miR－34a發(fā)揮作用的始動(dòng)基因，miR－34a缺失的胰腺癌患者p53抗腫瘤作用受影響［9］。Hermeking 等［10］進(jìn)一步研究指出，端粒酶的氧化應(yīng)激和癌基因的活化等因素可導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)而活化p53，再級(jí)聯(lián)激活miR－34，與Bcl－2等形成復(fù)合物，抑制或降解下游基因的表達(dá)［11］。本研究顯示，Res干預(yù)組 T24細(xì)胞miR－34a的表達(dá)是對(duì)照組的4.1倍，由此推測(cè)Res可能通過(guò)促進(jìn)miR－34a表達(dá)誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡，但其與miR－34a之間的確切交互關(guān)系尚需進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究初步探討了Res對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的影響及miR－34a在其中的作用，可為膀胱癌在基因水平上的干預(yù)治療及研制新型防治藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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A study of resveratrol to suppress proliferation of human bladder cancer cell line T24 and to affect expression of miR－34a

WANG Wei1，LI Tan2，LI Ying1，and LI Hui1.1.Department of Nephrology，The Affiliated Hospital of Logistics Institute of the Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300162;2.Department of Immunology，Logistics Institute of the Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China

ObjectiveTo investigate the effects of resveratrol on proliferation of human bladder cancer cell line T24，and the role of miR－34a in its mechanism.Methods T24 cells were treated with resveratrol in different concentrations for 24 h.Cell proliferation was validated by MTT.Flow cytometry was used to analyse apoptosis.The expression of miR －34a was detect by real－time PCR.Results Resveratrol could inhibit the proliferation of T24 in a dose dependent manner，induce apoptosis and increase the expression of p53 significantly.Furthermore，the level of miR －34a in T24 cells was higher in resveratrol－treated group than that in the control group.Conclusions Resveratrol can suppress the proliferation of human bladder cancer cells，which may be attributed to inducing apoptosis，up－regulating miR －34a and p53.

resveratrol;bladder cancer;apoptosis;miR－34a;p53

R737.14

武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院種子基金面上項(xiàng)目(FYM201211)，武警后勤學(xué)院科研基金面上項(xiàng)目(WYM201016)

王 偉，男，1976年出生。碩士，副主任醫(yī)師。主要從事泌尿系統(tǒng)的基礎(chǔ)與臨床研究。

300162 天津，武警后勤學(xué)院:1.附屬醫(yī)院腎病科;2.免疫學(xué)教研室

李 輝，E－mail:wjliyisheng99@sina.com

(2012－05－19收稿 2012－08－11修回)

(責(zé)任編輯 尤偉杰)