國(guó)強(qiáng)華，宋維鵬，王慶勝，劉 麗

組織塊貼壁法培養(yǎng)人腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的研究

國(guó)強(qiáng)華1，宋維鵬2，王慶勝1，劉 麗1

目的采用組織塊貼壁法建立成人腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞體外模型，為心血管疾病研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法運(yùn)用組織塊貼壁法對(duì)成人腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，用倒置顯微鏡和免疫組化進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定。結(jié)果運(yùn)用組織塊貼壁法成功獲得大量單個(gè)成人腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞呈典型“峰－谷”樣生長(zhǎng)，免疫組化顯示胞漿內(nèi)平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性表達(dá)。經(jīng)胰酶消化后可傳20代。結(jié)論通過(guò)組織塊貼壁法可以獲得成人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human vascular smooth muscle cell，hVSMC)，為心血管疾病的實(shí)驗(yàn)研究提供良好的材料。

人;腸系膜動(dòng)脈;平滑肌;細(xì)胞培養(yǎng)

動(dòng)脈中膜的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在心血管疾病發(fā)生中具有重要作用。研究表明，高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等多種疾病的病理過(guò)程常伴有VSMC的舒縮、遷移、增殖和纖維化。動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)已經(jīng)被廣泛用于心血管疾病發(fā)病機(jī)制的研究［1－3］。目前，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍選用動(dòng)物的動(dòng)脈作為血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的來(lái)源［4，5］，很少采用成人動(dòng)脈。盡管動(dòng)物的血管平滑肌細(xì)胞較容易培養(yǎng)，但其生物學(xué)特性與人的血管平滑肌細(xì)胞存在不少的差異，特別是在基因表達(dá)、抗原特異性方面，據(jù)此得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能準(zhǔn)確反映人體的實(shí)際情況。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)組織塊貼壁法建立穩(wěn)定的成人動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)模型［6，7］，為開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及液體配置 DMEM/F12干粉(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(Trypsin，Sigma公司)、EDTA(Boehringe公司)、青霉素、鏈霉素、生理鹽水、PBS緩沖液、DHank’s液、25 ml塑料培養(yǎng)瓶(Coming公司)、抗平滑肌Actin單克隆抗體和免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物公司)。將培養(yǎng)液配成含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每毫升中加入100 U青霉素和100 μg鏈霉素，調(diào) pH值為7.0;100ml DHank液中加0.25 g胰蛋白酶和0.125 g EDTA配成濃度為0.25%胰酶和0.0125%EDTA的混合溶液，調(diào)pH值為8.0。配好的試劑分裝后－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 成人腸系膜動(dòng)脈的分離 選擇腹部外科手術(shù)中摘除的腸系膜動(dòng)脈［供體年齡為(50±5)歲，無(wú)高血壓及器質(zhì)性心血管疾?。?，該醫(yī)療行為得到秦皇島市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可。手術(shù)室中分離切取人腸系膜動(dòng)脈5～8 cm，用生理鹽水將血管內(nèi)外的血跡反復(fù)沖洗干凈，移入含20%胎牛血清的無(wú)菌DMEM/F12培養(yǎng)液中。

1.3 VSMC的原代培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)內(nèi)，在PBS平衡液的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用眼科鑷去除血管外膜及結(jié)締組織，露出白色的中膜，放入另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中，縱向剪開血管，將血管內(nèi)壁沖洗數(shù)次，用無(wú)菌棉花輕輕擦拭數(shù)次以除去內(nèi)膜只留取中膜，眼科鑷夾取中膜組織，用1 ml含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗后，放入另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中，滴少許含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，用眼科剪剪成1 mm的小塊，用彎頭吸管將小塊移入25 ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，以3～5塊/cm2密度均勻貼于培養(yǎng)瓶底，培養(yǎng)瓶底內(nèi)加入1 ml含20%胎牛血清的無(wú)菌DMEM/F12培養(yǎng)液，緩慢豎直培養(yǎng)瓶，以培養(yǎng)液剛未浸沒(méi)小塊為宜，放至5%CO2、37℃培養(yǎng)箱干涸2～4 h后輕輕翻轉(zhuǎn)，使小塊剛好浸入培養(yǎng)液中，原代培養(yǎng)每3 d換1次液，待4～5周細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后即可傳代。

1.4 VSMC的傳代培養(yǎng) 傳代前1 d換液1次，傳代時(shí)棄去原培養(yǎng)液，PBS輕輕沖洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶和0.0125%EDTA的混合溶液2 ml，培養(yǎng)箱中消化90 s，鏡下觀察見細(xì)胞收縮變圓、間隙增寬，立即加入新鮮培養(yǎng)液4 ml終止消化，用彎頭吸管將細(xì)胞均勻吹打下來(lái)，離心后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)達(dá)到107個(gè)/ml，調(diào)整細(xì)胞濃度為105個(gè)/ml，按1∶2傳代，每3 d換液1次，傳代周期為6～9 d。

1.5 形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察 應(yīng)用相差顯微鏡觀察細(xì)胞大小、形態(tài)、生長(zhǎng)特點(diǎn)及排列方式等。

1.5.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將第3代細(xì)胞胰蛋白酶消化后以105個(gè)/ml的細(xì)胞濃度接種于置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%后取出細(xì)胞爬片，PBS清洗5次，每次5 min。用4%多聚甲醛固定20 min，再PBS沖洗5次，每次5 min，然后用抗平滑肌Actin單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以VSMC胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)計(jì)數(shù)陽(yáng)性百分率。

2 結(jié) 果

2.1 體外培養(yǎng)生長(zhǎng)情況 原代成人腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞貼壁牢固，3～4周后細(xì)胞呈充分伸展梭型，4～5周后即可傳代，傳代后12 d即可貼壁，4～5 d可出現(xiàn)VSMC特有的“峰－谷”樣生長(zhǎng)，這是平滑肌特征性生長(zhǎng)表現(xiàn)(圖1)。

圖1 hVSMC細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

2.2 形態(tài)學(xué)觀察和鑒定 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，未貼壁前細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)密度高，不透明，胞核多為卵圓形，有多個(gè)核仁;貼壁后細(xì)胞胞質(zhì)透明，彼此融合在一起，細(xì)胞呈梭形或多角形，核居中央，呈橢圓形(圖2)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)平滑肌α－肌動(dòng)蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性顯示，細(xì)胞計(jì)數(shù)陽(yáng)性率為98%。

圖2 hVSMC細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色(×200)

3 討 論

研究血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)行為是且前探討動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的熱點(diǎn)之一［6，7］，然而成人的血管平滑肌細(xì)胞(hVSMC)培養(yǎng)難度很大，目前大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室仍用較易培養(yǎng)的動(dòng)物血管平滑肌細(xì)胞來(lái)代替hVSMC，但鑒于其生物學(xué)特性與人源細(xì)胞存有一定差異，特別是在基因表達(dá)、抗原特異性方面，故使用人的血管平滑肌細(xì)胞成為許多心血管疾病研究的理想材料［1，8］。

本實(shí)驗(yàn)成功地建立了用人的腸系膜動(dòng)脈培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞的體外模型，培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞呈典型“峰－谷”樣生長(zhǎng)，免疫組化顯示胞漿內(nèi)平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性表達(dá)。組織塊貼壁法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的初步訓(xùn)練，即可掌握相關(guān)的無(wú)菌操作和技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)需注意以下幾點(diǎn):(1)培養(yǎng)液。選用DMEM/F12培養(yǎng)液，因其內(nèi)Ca2+和Mg2+含量高，營(yíng)養(yǎng)豐富并含有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的因子及成分，保證成人血管平滑肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好。培養(yǎng)液配置時(shí)的pH值應(yīng)在7.0左右，因?yàn)閔VSMC耐酸不耐堿，在稍微偏酸性的環(huán)境下生長(zhǎng)的比較好。(2)血清。胎牛血清比小牛血清好，原代培養(yǎng)時(shí)用20%(v/v)胎牛血清，傳代培養(yǎng)時(shí)可改用l0%(v/v)胎牛血清。(3)組織塊。不應(yīng)剪切過(guò)小，1 mm2最合適，否則組織塊損傷大，水分容易喪失，導(dǎo)致原代培養(yǎng)失敗。組織塊間距需2～3 mm，以保證細(xì)胞從組織塊游出后有足夠的生長(zhǎng)空間并保持局部細(xì)胞密度的均勻，從而獲得更多的原代細(xì)胞。(4)原代培養(yǎng)。如果有組織塊未貼壁，可將其重新擺放至瓶底，干涸2～3 h后，使其重新貼壁，再浸沒(méi)于培養(yǎng)液中。該法不會(huì)影響同瓶中其他已萌出細(xì)胞的生長(zhǎng)。(5)細(xì)胞純度。組織塊貼壁法培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞純度相對(duì)低，但是傳代至第3代時(shí)，細(xì)胞的純度即可達(dá)到95%以上，適于進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。(6)免疫組化。α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－SMA)是細(xì)胞內(nèi)六種肌動(dòng)蛋白亞類之一，在所有真核細(xì)胞中的表達(dá)都高度保守。它們沿微管組成了細(xì)胞骨架的主要成分，編碼它的基因是相對(duì)局限于在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的少數(shù)幾個(gè)基因之一，公認(rèn)是血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。

本研究建立了用人的腸系膜動(dòng)脈培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞的體外模型，所介紹的組織貼塊法培養(yǎng)的成人腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，較為成熟，簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易行，可為心血管疾病病因、機(jī)制的研究和防治提供一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)材料。

［1］梁若斯，陳 德.成人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2002，12(10):31－34.

［2］周曉莉，雷 寒，柳 青.血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定［J］. 重慶醫(yī)學(xué)，2005，34(6):877－878.

［3］呂 平，申海濤，張 浩.消化法培養(yǎng)大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(2):137－139.

［4］周曉莉，雷 寒，柳 青.小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)［J］. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2005，25(6):564－567.

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［6］司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.西安:世界圖書出版社，2004:71－77.

［7］蔡文琴.現(xiàn)代實(shí)用細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2003:13－16.

［8］郭永平，張敏芳，袁江姿.人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)［J］. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(9):1008－1091.

Experimental study of human mesenteric artery smooth muscle cell cultured by tissuepiece inoculation

GUO Qianghua，SONG Weipeng，WANG Qingsheng，and LIU Li.1.Department of Cardiology;2.ICU，Qinhuangdao First Hospital，Qinhuangdao 066000，China

ObjectiveTo establish a method for culture of human mesenteric artery smooth muscle cell(hVSMC)by tissuepiece inoculation in vitro and to provide new technology to study cardiovascular diseases.Methods The tissue－piece inoculation method was applied to cell primary culture of hVSMC.Morphology of the cells was observed by inverted microscopy and identified by immunohistochemical methods.Results A great quantity of single hVSMC were obtained by tissue－piece inoculation.The cultured hVSMC showed typical“peak and valley”pattern and immunohistochemical staining showed that all the cells were positive.Conclusions The hVSMC are obtained by tissue－piece inoculation.This method provides good study material to research cardiovascular diseases.

human beings;mesenteric artery;smooth muscle cells;cell culture

R541.3

國(guó)家十一五科技支撐計(jì)劃資助課題(2006BMI01A03－2)

國(guó)強(qiáng)華，男，1979年出生。碩士，主治醫(yī)師。主要從事老年心血管病研究。

066000，秦皇島市第一醫(yī)院:1.心內(nèi)三科;2.重癥醫(yī)學(xué)科通訊作者:劉 麗，E－mail:lucy301bj@vip.sina.com

(2012－06－08收稿 2012－07－26修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)