，， ,3，

(1.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海倫農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外觀測研究站，黑龍江 哈爾濱 150081；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.中國科學(xué)院 研究生院，北京 100049； 4.中國科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085)

在土壤微生物群落生態(tài)學(xué)研究中量化微生物群落的組成、確定群落的優(yōu)勢種群和檢測具有某種生物學(xué)功能微生物類群的豐度是非常必要的[1-2]。然而，由于許多環(huán)境微生物的不可培養(yǎng)性，為研究增添了一些障礙[3]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)技術(shù)作為一種核酸定量的手段，以其高靈敏性、高特異性、高精確度、實(shí)時(shí)性和污染少等優(yōu)點(diǎn)，在微生物生態(tài)學(xué)中逐漸得到廣泛的應(yīng)用[2]。同時(shí)與其他的分子生物學(xué)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，不僅可以定性也可以定量研究微生物群落結(jié)構(gòu)組成及數(shù)量變化，深入探索微生物群落與環(huán)境因子之間的相互作用及其動(dòng)態(tài)變化過程[2]。Real-Time PCR技術(shù)在土壤微生物環(huán)境監(jiān)測和研究上的應(yīng)用始于近年，國外在環(huán)境中微生物群落變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測、微生物群落生理代謝研究和環(huán)境微生物群落分布的研究等方面已有了很多的應(yīng)用[2,4-7]，國內(nèi)在土壤微生物研究領(lǐng)域這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用方面的報(bào)道還比較少。Real-Time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣品一般是含有與PCR目的片斷同源且純度較高的DNA模板[8-9]，但分析土壤環(huán)境樣品時(shí)，特別是目的片斷為某些功能基因的時(shí)候，很難得到這樣的標(biāo)準(zhǔn)品。因此，利用構(gòu)建克隆子的方法制作土壤樣品的標(biāo)準(zhǔn)樣品，并對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立土壤樣品的實(shí)時(shí)Real-Time PCR檢測體系，為Real-Time PCR這一技術(shù)在土壤微生物群落生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用作初步嘗試，為后續(xù)動(dòng)態(tài)研究土壤微生物群落變化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

共采集3個(gè)土壤樣品作為處理，編號(hào)P1和P2的兩個(gè)樣品采自大慶市讓胡路區(qū)代號(hào)為分別為中101-X308和中922-X309的兩處油井附近，生產(chǎn)時(shí)間均不足5 a。樣品C采自中國科學(xué)院海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站裸地生態(tài)系統(tǒng)土壤，無多環(huán)芳烴污染始和農(nóng)藥施用歷史。3個(gè)土壤樣品均為去除表層后5 cm～15 cm深的土壤，pH值分別為9.68、9.02和7.56。

1.2 Real-Time PCR測定總細(xì)菌數(shù)量

1.2.1土壤微生物基因組總DNA提取。土壤微生物DNA提取采用Bio 101 FastDNA SPIN Kit(Bio 101，Inc.，USA)，土壤用量為0.5 g鮮土。用體積分?jǐn)?shù)為1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸蛋白質(zhì)分析儀(Nanodrop)檢驗(yàn)DNA質(zhì)量并確定其濃度。

1.2.2普通PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化。優(yōu)化后的PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下：50 μL體系，buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl21.5 μL，BSA 0.3 μL，Taq 0.3 μL，H2O 35.9 μL，引物每條各100 nM，模版DNA 1 μL。16S rDNA片段PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94 ℃ 4 min后，94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。

引物序列：16Sr DNA序列：F27 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，R1492 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′[10]，引物訂自上海生物工程公司。

1.2.3Real-Time PCR標(biāo)準(zhǔn)樣品的制作。選取1份質(zhì)量較高的PCR產(chǎn)物，采用DNA凝膠純化試劑盒純化擴(kuò)增后的基因片段，將片斷連接在pGEM-T Easy 載體中，然后轉(zhuǎn)化到E.coli.JM109中，涂布到含有氨芐青霉素(Ampicillin)/IPTG/X-Gal的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)16 h～24 h。隨機(jī)挑選2～3個(gè)白斑克隆子測序，基因測序工作由上海生物工程公司完成。

將測序結(jié)果導(dǎo)入MEGA 4.0軟件，經(jīng)過剪裁處理選取一個(gè)插入片段序列完整(兩端引物完整)、長度合適(目標(biāo)長度1 500 bp)的克隆子。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取克隆子的質(zhì)粒，測定其DNA濃度，并將其以10倍為間隔系列稀釋成實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4樣品定量。將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品一起進(jìn)行Real-Time PCR檢測，包括陰性對照在內(nèi)每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。Real-Time PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中包含0.5 μL(約2.5 ng)模板DNA，12.5 μL SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa Biotechnology),引物各100 nM，反應(yīng)在Axygen公司200 μL圓頂PCR管中進(jìn)行。Real-Time PCR定量擴(kuò)增儀型號(hào)為iQ5(Bio-rad,USA)。16S rDNA片段PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94 ℃ 4 min后，94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)中熒光收集在83 ℃下進(jìn)行，以防止由于引物二聚體的存在所引起的誤差。 溶解曲線程序?yàn)?5 ℃～98 ℃,每0.2 ℃讀數(shù),其間停留6 s。Real-Time PCR測定控制軟件iCycler software(version 1.0.1384.0 CR)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的測序結(jié)果

經(jīng)過篩選，最后確定將細(xì)菌16S rDNA 序列的C0-B31號(hào)克隆子作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣品，其16S rDNA片段序列長度為1467 bp，符合完整的16S rDNA序列要求。兩端劃線部分為引物，且序列完整。該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫相似序列比對結(jié)果表明，其與Actinoplanes sp.SE50/110(CP003170)具有98 %的相似度。

2.2 Real-Time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果及可信性分析

將10倍濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品PCR過程中檢測熒光的結(jié)果繪制成擴(kuò)增曲線，見圖1。如圖所示，各樣品平行間所測定的Ct值差異很小，即樣品平行間一致度較好試驗(yàn)測定值可信度較高。

圖1 Real-Time PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 Real-Time PCR amplification curve

圖2 Real-Time PCR溶解曲線Fig.2 Real-Time PCR melting curve

利用10倍濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品PCR過程中熔解溫度的測定值做熔解曲線，見圖2，熔解曲線無雜峰表明擴(kuò)增片段長度一致無引物二聚體。

分別以10倍濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品中DNA模板濃度與Ct值為橫縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。由于Real-Time PCR絕對定量是建立在模板的初始濃度與域值循環(huán)數(shù)Ct(Cycle threshold)值關(guān)系的基礎(chǔ)上，因此，為保證樣本定量有穩(wěn)定可重復(fù)的試驗(yàn)結(jié)果，Real-Time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)的優(yōu)化非常的重要。理論上一條合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有3個(gè)特點(diǎn)：一致的重復(fù)反應(yīng)、高的線性(R2> 0.980)和高的擴(kuò)增效率(E：90 %～105 %)以及斜率(S≈-3.32)。標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)符合要求(標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增效率E=101.7 %，R2=0.985，S=-3.28)且重復(fù)性好，說明以此標(biāo)準(zhǔn)樣品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線是合格的。

圖3 Real-Time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Real-Time PCR standard curve

2.3 細(xì)菌的定量結(jié)果

利用Real-Time PCR的方法測定了3個(gè)土壤樣品中16S rDNA片段的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示：編號(hào)為C的土壤樣品細(xì)菌16S rDNA片段拷貝數(shù)達(dá)到5.0×109個(gè)·g-1，高于其它兩個(gè)處理。編號(hào)P2的土壤16S rDNA片段拷貝數(shù)為4.0×109個(gè)·g-1，編號(hào)P1的土壤總細(xì)菌的含量最低，16S rDNA片段拷貝數(shù)為1.4×109個(gè)·g-1。

3 討 論

傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法定量研究土壤微生物的群落數(shù)量變化有很大的缺陷，因?yàn)樵诂F(xiàn)有技術(shù)下可分離培養(yǎng)的微生物只占環(huán)境微生物的0.1 %～10 %，平板計(jì)數(shù)法會(huì)大大低估土壤微生物的真實(shí)數(shù)量。利用Real-Time PCR技術(shù)對土壤微生物細(xì)胞個(gè)體數(shù)量進(jìn)行絕對定量的方法快捷且準(zhǔn)確性比較高，不僅可以定量細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物類群，而且還可以對某些微生物功能基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量，從而有目的的對功能微生物進(jìn)行研究。利用16S rDNA片段PCR克隆庫作為標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法簡便且可以重復(fù)使用，是制作標(biāo)準(zhǔn)品的好方法。在不同細(xì)菌細(xì)胞中16S rDNA片段拷貝數(shù)一般為每個(gè)細(xì)胞1～13個(gè)，因此如定義平均細(xì)胞拷貝數(shù)為6.5個(gè)，則本研究中C、P1和P2樣品的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)分別為7.7×108個(gè)·g-1、2.2×108個(gè)·g-1和6.2×108個(gè)·g-1，這一結(jié)果要比傳統(tǒng)方法得到的結(jié)論高1～3個(gè)數(shù)量級(jí)[11]。

反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率大于100 %的原因有可能是因?yàn)榉磻?yīng)抑制劑的存在。因?yàn)榉磻?yīng)樣品模板中反應(yīng)抑制劑的濃度也隨稀釋度增加而減小，低濃度模板樣本中抑制劑的濃度低對反應(yīng)Ct值的延遲程度較小，導(dǎo)致低濃度樣品Ct值比理想情況略高，使標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的絕對值以及由其計(jì)算所得的擴(kuò)增效率會(huì)略微增加。由于本試驗(yàn)樣本DNA來自于土壤，導(dǎo)致以此為基礎(chǔ)制作的標(biāo)準(zhǔn)樣品也不可避免地含有微量的PCR反應(yīng)抑制劑，所以出現(xiàn)反應(yīng)擴(kuò)增效率略大于100 %屬于正?，F(xiàn)象，只要其小于105 %就不會(huì)顯著影響定量結(jié)果。綜上所述，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系可以較傳統(tǒng)方法更靈敏地定量未知模板的土壤細(xì)菌數(shù)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] 夏 月,Khan S,朱永官,等.限制性片段長度多態(tài)性分析(ARDRA)方法對重金屬污染土壤中細(xì)菌群落多樣性的研究 [J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(6):953-960.

[2] 張 晶,張惠文,張成剛.實(shí)時(shí)熒光定量PCR及其在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用 [J].生態(tài)學(xué)報(bào),2005,25(6):1445-1450.

[3] 沈菊培,張麗梅,鄭袁明,等.土壤宏基因組學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用 [J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2007,18(1):212-218.

[4] 張 蓓,沈立松.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的研究進(jìn)展及其應(yīng)用 [J].國外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊,2003,24(6):327-329.

[5] 歐陽松應(yīng),楊 冬,歐陽紅生,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用 [J].生命的化學(xué),2004,24(1):74-76.

[6] 李文濤,王俊東,楊利峰,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用 [J].生物技術(shù)通訊,2006,17(1):112-114.

[7] 付春華,陳孝平,余龍江.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用和進(jìn)展 [J].激光生物學(xué)報(bào),2005,14(6):466-471.

[8] 羅勇軍,劉 昕.實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備及應(yīng)用 [J].重慶醫(yī)學(xué),2005,34(3) :414-415.

[9] 朱永芳.實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測技術(shù) [M].北京:中國計(jì)量出版社,2003.

[10] Lane D J.16S/23S rRNA sequencing Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics [M].New York:John Wiley&Sons,1991.

[11] 丁克強(qiáng),駱永明,劉世亮,等.多環(huán)芳烴菲對淹水土壤微生物動(dòng)態(tài)變化的影響 [J].土壤,2002,34(4):229-236.