潘 崢 陳 軍 覃冠德 覃思繁

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢。細胞型Fas相關(guān)的死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(FADD-like interleukin-1β- converting enzyme inhibintory protein，c-FLIP)被認為是1種重要的細胞凋亡抑制蛋白，在結(jié)構(gòu)上與Caspase-8相似，但無Caspase-8的蛋白水解活性。它與含死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白(Fas associated death domain，F(xiàn)ADD)結(jié)合，抑制Caspase-8活化，使Caspase-8介導(dǎo)的蛋白酶不能發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，從而阻斷Fas介導(dǎo)的死亡受體途徑的細胞凋亡[1]。我們應(yīng)用免疫組化方法檢測乳腺癌與癌旁組織中c-FLIP和Caspase-8表達的情況，探討它們在人乳腺癌中的表達情況及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集2004年1月～2005年8月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的乳腺癌標(biāo)本80例，年齡26～72歲，中位年齡43歲；患者術(shù)前均未進行任何抗癌治療，所有病例隨訪5年。TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ期22例；組織學(xué)分級：Ⅰ～Ⅱ級43例，Ⅲ級37例。每例均取癌及對應(yīng)癌旁肝組織(距腫瘤邊緣2 cm)。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)檢查采用Envision兩步法。c-FLIP濃縮型兔抗人多克隆抗體購自美國Neomarkers公司，Caspase-8濃縮型兔抗人多克隆抗體購自美國Labvision公司，抗體稀釋濃度為1∶100。即用型快捷MaxvisionTM檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)科技公司。整個過程按試劑盒說明書進行。每批染色均設(shè)已知陽性切片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(phosphatic buffered saline，PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷

c-FLIP及Caspase-8蛋白陽性信號均主要定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒為陽性細胞。由2位醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片。陽性判斷根據(jù)染色程度和免疫陽性細胞占腫瘤細胞總數(shù)百分比綜合記分。按切片中癌細胞染色強度計分：0分細胞無顯色；1分呈淡黃色；2分呈棕黃色；3分呈棕褐色(染色深淺需與背景著色相對比)；再按切片中陽性癌細胞數(shù)所占的百分比評分：0分為陰性，1分為≤10%；2分為11%～50%，3分為50%～75%，4分為75%以上。染色強度與陽性細胞百分比的乘積>3分才算免疫反應(yīng)陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS11.0軟件進行χ2檢驗，Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中c-FLIP和Caspase-8的表達

乳腺癌組織及癌旁組織中c-FLIP表達陽性率分別為72.5%(58/80)和48.8%(39/80)，2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.452 ，P=0.001)；Caspase-8表達陽性率分別為23.8%(19/80)和53.8%(43/80)，2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.168，P=0.000)。

2.2 c-FLIP和Caspase-8表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

通過比較c-FLIP和Caspase-8表達與臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，c-FLIP表達陽性在TNM分期、組織學(xué)分級、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)及C-erbB-2表達等組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Caspase-8陽性表達在組織學(xué)分級、腫瘤大小等組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (表1)。

表1 c-FLIP和Caspase-8表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 c-FLIP和Caspase-8在乳腺癌組織中表達的相關(guān)性

c-FLIP和Caspase-8表達在乳腺癌組織中表達呈顯著負相關(guān)(γ=-0.380，P=0.001)(表2)。

表2 乳腺癌組織中c-FLIP和Caspase-8表達的關(guān)系(例)

3 討論

細胞凋亡是1種由基因控制的自主性有序死亡，對保持正常生長及自身穩(wěn)定有十分重要意義。在對凋亡分子的進一步研究中，發(fā)現(xiàn)了c-FLIP[2]，它是Fas/FasL細胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑的抑制蛋白，在腫瘤壞死因子受體超家族的死亡受體抑制中扮演了1個重要角色。研究表明c-FLIP具有雙重功能，F(xiàn)asL和c-FLIP的濃度對信號的傳導(dǎo)具有決定性的作用，高濃度存在于細胞中時會抑制Fas介導(dǎo)的凋亡；相反，在低濃度或生理情況下，則發(fā)揮促凋亡作用[3,4]，故推測c-FLIP過量表達在腫瘤發(fā)生中起重要作用。Ryu等[5]檢測了52例大腸腺癌組織，陽性表達率為78.8%，顯著高于大腸息肉和癌旁正常組織。我們的研究亦得到了相近的結(jié)果，80例乳腺癌組織的陽性率顯著高于癌旁組織。同時，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，c-FLIP的高表達與TNM分期、組織學(xué)分級、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)及C-erbB-2表達情況密切相關(guān)，提示其在乳腺癌的進展過程中亦起著十分重要的作用。

Caspases是1種細胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶家族，細胞內(nèi)這些酶以酶原形式存在，但能被廣泛的細胞死亡刺激信號所激活。隨著上游始動Caspases激活下游效應(yīng)Caspases，Caspases形成自身激活瀑布樣組織形式。本質(zhì)上有2種主要的Caspases激活通路：線粒體-細胞色素C-Caspase-9途徑和腫瘤壞死因子死亡受體超家族介導(dǎo)-Caspase-8途徑[4]。從理論上推測Caspase-8失活可導(dǎo)致細胞凋亡失控，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。我們的研究表明，Caspase-8在乳腺癌組織中的表達顯著低于癌旁組織，且與組織學(xué)分級及腫瘤大小密切相關(guān)，提示Caspase-8可能參與了乳腺癌的發(fā)生及進展。

c-FLIP的作用底物目前已有報道的有FADD、Caspase-3、Caspase-8、Caspases-10等[6,7]，目前對c-FLIP抑制凋亡作用的具體機制較為公認的觀點是Fas介導(dǎo)的信號可使c-FLIP的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)與FAD(Fas-associated death domain)和Caspase-8結(jié)合，競爭性抑制Caspase-8結(jié)合到死亡誘導(dǎo)復(fù)合體(DISC)上；另外類似于Caspase-8前體，c-FLIP可作為激活的 Caspase-8底物，產(chǎn)生1個C端被水解掉的c-FLIP蛋白，與Caspase-8緊密結(jié)合，防止Caspase-8的進一步激活，從而阻斷了Fas介導(dǎo)的凋亡信號的傳導(dǎo)[3]。從理論上分析，c-FLIP的高表達會使Caspase-8失活，從而導(dǎo)致細胞凋亡失控，進一步促進腫瘤的發(fā)生。我們的研究發(fā)現(xiàn)，兩者在乳腺癌的表達確實存在負相關(guān)關(guān)系，提示兩者在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中分別發(fā)揮著正負調(diào)節(jié)的作用；但結(jié)果亦表明兩者僅是弱的負相關(guān)關(guān)系(γ=-0.380)，提示有更多因素參與了兩者對細胞凋亡的調(diào)節(jié)，兩者并非單純的一對一的調(diào)節(jié)關(guān)系。

總之，c-FLIP高表達和Caspase-8的失活在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展中起了重要的作用，但其具體作用機制還有待進一步研究闡明。聯(lián)合檢測兩者在乳腺癌中的表達情況，對揭示乳腺癌的發(fā)病原因，病情進展的評估及預(yù)后判斷有著重要意義，并為乳腺癌的基因靶向治療提供了新的途徑。

[1] Clarke K,Debiasi RL,Meintzer SM,et al.Inhibition of NF-kappa B activitiy and cFLIP expression contribute to viral-induced apoptosis〔J〕.Apoptosis,2005,10 (3):513.

[2] Irmler M,Thome M,Hahne M,et al.Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP〔J〕.Nature,1997,388(6638):190.

[3] Bagnoli M,Canevari S,Mezzanzanica D.Cellular FLICE-inhibintory protein (c-FLIP) signalling:A key regulator of receptor-mediated apoptosis in physiologic context and in cancer〔J〕.The International Journal of Biochemistry &Cell Biology,2010,42(2):210.

[4] Krueger A,Baumann S,Riess D,et al.Analysis of CD95 threshold signaling：triggering of CD95(FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling〔J〕.J Biol Chem,2007,282(18):13664.

[5] Ryu BK,Lee MG,Chi SG,et al.Increased expression of cFLIP(L) in colonic adenocarcinoma〔J〕.J Psthol,2001,194(1):15.

[6] Walczak H,Haas TL.Biochemical analysis of the native TRAIL death-inducing signaling complex〔J〕.Methods Mol Biol,2008,414:221.

[7] Armbruster N,Trautmann A,Br?cker EB,et al.Suprabasal spongiosis in acute eczematous dermatitis:cFLIP maintins resistance of basal keratinocytes to T-cell-mediated apoptosis〔J〕.J Invest Dermatol,2009,129(7):1696.