院海英，徐芳，呂新華，崔百明，黃先忠

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

小擬南芥高鹽脅迫誘導(dǎo)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序分析

院海英，徐芳，呂新華，崔百明，黃先忠

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

以新疆小擬南芥為材料，分離了小擬南芥經(jīng)500mmol／L NaCl脅迫處理的幼苗總RNA，采用改良的SMART cDNA合成方法合成第一鏈cDNA，采用LD PCR的方法合成第二鏈cDNA，經(jīng)BP反應(yīng)重組到入門載體pDONR207上，構(gòu)建了小擬南芥高鹽脅迫的入門cDNA文庫(kù)。文庫(kù)插入片段平均大小為1.1kb，陽(yáng)性克隆率為94%。文庫(kù)經(jīng)隨機(jī)挑選克隆測(cè)序，生物信息學(xué)分析初步獲得了10個(gè)有功能的基因，其中包含各種酶如水解酶、氧化還原酶等；功能蛋白如離子運(yùn)輸通道蛋白、脅迫誘導(dǎo)蛋白，細(xì)胞色素蛋白及激素受體蛋白基因等。可以利用入門文庫(kù)構(gòu)建各種目的cDNA文庫(kù)，本研究為將來從小擬南芥中篩選耐鹽基因奠定了基礎(chǔ)。

新疆小擬南芥；耐鹽；入門文庫(kù)；表達(dá)文庫(kù)；BP重組

早春短命植物，在新疆分布豐富。由于其生活史短，具有一定的抗寒、抗旱、耐鹽堿能力，而備受關(guān)注。小擬南芥（Olimarabidopsis pumila）為無苞芥屬（Olimarabidopsis），其親源關(guān)系與模式植物擬南芥十分接近［1－2］，且比擬南芥具有更好的耐鹽性能［3－5］，從小擬南芥中挖掘耐鹽相關(guān)基因，并進(jìn)行相關(guān)功能研究，不僅能豐富植物響應(yīng)高鹽脅迫的分子機(jī)理，也可利用耐鹽基因培育耐鹽作物品種。

對(duì)于基因組序列未知的物種，構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，是進(jìn)一步開展分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。經(jīng)典cDNA文庫(kù)的創(chuàng)建不能滿足大規(guī)模、高通量篩選新基因的要求［6］。當(dāng)前，很多新的合成全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法得到了發(fā)展，已成為功能基因組學(xué)研究的重要手段之一［7］。

Gateway技術(shù)利用噬菌體位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)的BP和LR雙向反應(yīng)，首先將cDNA穿梭到入門載體上，形成入門文庫(kù)，然后根據(jù)研究目的不同選擇不同的表達(dá)載體，通過LR反應(yīng)使cDNA定向重組到任何Gateway化的表達(dá)載體上，形成各種表達(dá)文庫(kù)，整個(gè)過程無需酶切、連接，而且克隆效率高［8］。利用Gateway系統(tǒng)構(gòu)建高鹽脅迫cDNA文庫(kù)，從中篩選耐鹽相關(guān)基因，已在一些植物研究中運(yùn)用。

本研究參照Ni等［9］的方法，采用一種改良的SMART cDNA第一鏈合成的方法，在cDNA的5′及3′分別連上位點(diǎn)特定的接頭attB1和attB2，采用attB1和attB2序列特定的引物通過LD PCR的方法合成第二鏈cDNA，并通過BP重組反應(yīng)建立了新疆小擬南芥經(jīng)500mmol／L NaCl脅迫的幼苗cDNA入門文庫(kù)，并進(jìn)行文庫(kù)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

哥倫比亞生態(tài)型擬南芥（Col－0）和新疆小擬南芥（Olimarabidopsis pumila）種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌Top10、入門文庫(kù)載體pDONR207由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)向成斌教授饋贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑

RNA提取試劑盒Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶superscript III RTase、BP clonase均購(gòu)自Invitrogen公司。低融點(diǎn)瓊脂糖（BIO BASIC INC）、β－agaraseⅠ（New England Biolab）、Ex Taq（TaKaRa）。

1.2 方法

1.2.1 小擬南芥的培養(yǎng)

擬南芥和小擬南芥種子滅菌及播種方法參照院海英等［5］的方法進(jìn)行。首先將擬南芥和小擬南芥種子播種在1／2MS培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)1周后將幼苗轉(zhuǎn)入含500mmol／L NaCl的1／2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，鹽脅迫處理3d后觀察幼苗生長(zhǎng)狀況。構(gòu)建文庫(kù)的幼苗材料處理12h，將整株材料迅速置于液氮中冷凍，－80℃冰箱保存。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)及合成

參照文獻(xiàn)［9］中的方法設(shè)計(jì)引物，由北京六合華大基因科技有限股份公司合成。引物見表1。

表1 研究所用引物名稱Tab.1PCR primers used in this study

1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成

總RNA的提取參照Trizol試劑盒說明書提取。cDNA第一鏈的合成方法參照Ni等［9］的方法進(jìn)行。反應(yīng)體系經(jīng)42℃水浴1h再加入模板轉(zhuǎn)換引物attB1－（r）G3，然后再42℃水浴1h。

雙鏈cDNA的合成采用LD PCR的方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系如下：在100μL的反應(yīng)體系中，加入2μL first strand cDNA，10×Ex Taq Buffer 10μL，2.5mmol／L dNTPs 8μL，attB1 （10μmol／L）2 μL，attB2（10μmol／L）2μL，1UEx Taq，ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，2min后，95℃5s，64℃10s，72℃6min，20個(gè)循環(huán)，72℃延伸6min。取5 μL上述PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雙鏈cDNA質(zhì)量。

1.2.4 入門cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

LD PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%低融點(diǎn)瓊脂糖電泳，將大于500bp的片段切膠，低熔點(diǎn)膠經(jīng)β－agaraseⅠ酶解，具體方法參照說明書進(jìn)行。建立10μL的BP重組反應(yīng)，包含約100ng純化的雙鏈cDNA，pDONR207質(zhì)粒約100ng，2μL BP ClonaseⅡenzyme mix，1×TE Buffer（pH 8.0）補(bǔ)齊。25℃，過夜懸浮后，加2μL蛋白酶K，37℃10min，終止反應(yīng)。重組反應(yīng)產(chǎn)物通過電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Top 10，加入1mL SOC培養(yǎng)基，37℃，150r／min，輕搖1h，復(fù)蘇后，加入已高壓滅菌的甘油，使其終濃度達(dá)30%，即為構(gòu)建好的入門cDNA文庫(kù)，經(jīng)液氮速凍，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 文庫(kù)效率及測(cè)序分析

文庫(kù)效率分析采用文獻(xiàn)［6－7］中的方法。隨機(jī)挑選不同的克隆，采用文獻(xiàn)［9］中的方法提取質(zhì)粒，質(zhì)粒PCR引物為attL1和attL2。測(cè)序引物為attL1，測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。測(cè)序結(jié)果利用DNAstar軟件分析載體及引物序列后，采用 blast（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blasp）比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小擬南芥的鹽脅迫處理與RNA的提取

生長(zhǎng)1周的擬南芥和小擬南芥幼苗經(jīng)500 mmol／L NaCl脅迫培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)擬南芥基本白化死亡，而小擬南芥部分萎蔫，但依然正常生長(zhǎng)（圖1），說明小擬南芥具有一定的耐鹽能力，這和前期的研究結(jié)果［5］一致。

圖1 500mmol／L NaCl對(duì)擬南芥和小擬南芥的幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.1Comparison of shoot growth of Arabidopsis thaliana and Olimarabidopsis pumilastressed under 500mmol／L NaCl

取經(jīng)脅迫處理12h的幼苗，液氮研磨，提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，清楚的看到28S和18S的條帶（圖2），分光光度計(jì)檢測(cè)，結(jié)果表明OD260／OD280＝2.0，RNA濃度為1.27 μg／μL，說明RNA質(zhì)量較好。

圖2 小擬南芥經(jīng)500mmol／L NaCl脅迫處理的總RNA電泳圖Fig.2Total RNA isolated from Olumiarabidopsis pumila stressed under 500mmol／L NaCl

2.2 改進(jìn)的SMART PCR提高了cDNA合成的質(zhì)量

提取的總RNA采用改進(jìn)的SMART方法合成cDNA第一鏈［9］。第二鏈cDNA合成采用LD－PCR的方法。合成的雙鏈cDNA經(jīng)電泳檢測(cè)從上到下顯示一片“smear”，表明產(chǎn)生了更多高分子量的cDNA，合成的cDNA質(zhì)量更好（圖3）。

圖3 雙鏈cDNA電泳圖Fig.3Agarose gel electrophoresis of double strand cDNA

2.3 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與分析

經(jīng)檢測(cè)，入門文庫(kù)的滴度約為6×105cfu／mL，文庫(kù)總量約為1.2×106cfu。隨機(jī)挑取100個(gè)克隆，提取質(zhì)粒，利用attL1和attL2引物擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)（圖4），表明陽(yáng)性克隆率為94%，插入片段平均大小約1.1kb。這表明采用改進(jìn)的SMART cDNA合成方法增強(qiáng)了cDNA合成的能力，文庫(kù)質(zhì)量更高。

圖4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA文庫(kù)質(zhì)量Fig.4Agarose gel assays for cDNA inserts

隨機(jī)挑選30個(gè)克隆，利用attL1引物測(cè)序，測(cè)序產(chǎn)物去除載體序列，經(jīng)blast比對(duì)分析，其中10條具有同源基因及功能注釋（表2）。10個(gè)基因可以分成酶，包含烯醇酶、水解酶、氧化還原酶等；功能蛋白，如反向運(yùn)輸?shù)鞍?，鋁誘導(dǎo)蛋白，細(xì)胞色素C家族蛋白，赤霉素受體蛋白等。

表2 cDNA文庫(kù)測(cè)序分析Tab.2Sequencing analysis of cDNA library

3 結(jié)論與討論

在構(gòu)建入門cDNA文庫(kù)時(shí)，需要考慮兩個(gè)因素。一是cDNA質(zhì)量，二是怎樣從較少的起始材料中獲得高質(zhì)量的cDNA［7］。通過PCR擴(kuò)增第一鏈cDNA是一種從較少材料中獲得較高豐度雙鏈cDNA的有效方法，但需考慮兩點(diǎn)因素，首先cDNA第一鏈的5′和3′端要具有PCR擴(kuò)增的錨定引物，其次引物序列保證要有發(fā)生重組反應(yīng)的位點(diǎn)。本研究在合成第一鏈cDNA時(shí)3′末端加上attB2序列，通過模板轉(zhuǎn)換在5′末端和attB1接頭序列結(jié)合，隨后利用帶有重組位點(diǎn)的attB1和attB2引物，通過PCR擴(kuò)增獲得雙鏈cDNA，雙鏈cDNA也很容易進(jìn)行BP重組反應(yīng)。

構(gòu)建的小擬南芥經(jīng)500mmol／L NaCl脅迫的入門cDNA文庫(kù)，經(jīng)分析及隨機(jī)測(cè)序表明符合cDNA文庫(kù)的要求，隨機(jī)測(cè)序表明一些酶類基因所占比例較高，而且發(fā)現(xiàn)1個(gè)類似擬南芥液泡膜反向運(yùn)輸?shù)鞍谆騐acuolar Na＋／H＋antiporter的基因，植物抵御鹽脅迫的有效策略之一是將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na＋區(qū)隔化在液泡，這一過程是由液泡膜Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成的［10］。另外還有一個(gè)類似擬南芥赤霉素受體的基因GID1C，已有研究［11］表明，GID1C與阻遏植物生長(zhǎng)的DELLA蛋白相互作用，NaCl脅迫下，植物細(xì)胞DELLA蛋白高度積累，從而抑制植物生長(zhǎng)，有利于植物抵御不良環(huán)境。

新疆小擬南芥能在新疆逆境自然環(huán)境下廣泛生存，可能會(huì)有一些新的不同于其它植物的耐逆基因，也可能存在一些在逆境脅迫下特殊表達(dá)的基因，使小擬南芥能夠進(jìn)化出一套響應(yīng)逆境而生存的機(jī)制。利用本研究構(gòu)建cDNA文庫(kù)，無需酶切、連接等繁瑣的亞克隆策略，構(gòu)建的入門文庫(kù)符合cDNA文庫(kù)質(zhì)量要求，可以根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)的目的將入門文庫(kù)穿梭到不同的目的載體上，為進(jìn)一步從小擬南芥中挖掘新的耐鹽相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。

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Construction and Sequencing Analysis of cDNA Library Induced by High Salt Stress in Olimarabidopsis pumila

YUAN Haiying，XU Fang，LüXinhua，CUI Baiming，HUANG Xianzhong
（College of Life Science／Key laboratory of Agrobiotechnology，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

Total RNA was isolated from shoot of Olimarabidopsis pumila stressed with 500mmol／L NaCl.The first－strand cDNA was synthesized with superscript III RTase through an improved SMART cDNA synthesis method，the second－strand was synthesized via LD PCR amiplification，and the double－strand cDNA was recombined into entry vector pDONR207via Gateway BP Clonase.The entry cDNA library of Olimarabidopsis pumilainduced by high salt stress was thus constructed，with an average inserts size of 1.1kb，and the positive clone rate of 94%.Randomly－selected clones were sequenced，and through bioinformatics analvsis，10functional genes were obtained，including different enzymes such as oxidoreductase，hydroylase，etc，and function proteins，such as ion transporter proteins，stress induced protein，cytochrome b5protein，and phytohormone receptor protein，etc.Various expression libraries can be constructed based on the entry library，and this study laid a foundation of mining salt－tolerance genes fromOlimarabidopsis pumila.

Olimarabidopsis pumila；salt tolerant；entry library；expression library；BP recombination

Q943.2

A

1007－7383（2012）01－0001－04

2011－11－02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31060149），石河子大學(xué)高層次人才啟動(dòng)項(xiàng)目（RCZX200902）

院海英（1985－），女，碩士，專業(yè)方向?yàn)橹参镞z傳學(xué)；e－mail：yuanhaiying315＠126.com。

黃先忠（1974－），男，副教授，博士，從事植物遺傳學(xué)與基因組學(xué)研究；e－mail：xianzhongh＠shzu.edu.cn。