周 怡，張文兵，麥康森

（中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003）

凡納濱對蝦翻譯控制腫瘤蛋白Fortilin的畢赤酵母表達(dá)及其對血細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響＊

周 怡，張文兵＊＊，麥康森

（中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003）

翻譯控制腫瘤蛋白Fortilin是1種多功能蛋白，參與重要的細(xì)胞活動。并且，對蝦fortilin通過抑制病毒復(fù)制干擾病毒感染。參照Genbank中fortilin基因序列設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增得到凡納濱對蝦fortilin目的基因片段，EcoR I／Xba I雙酶切插入表達(dá)載體pGAPZαA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)博來霉素（Zeocin）抗性篩選及測序分析，獲得分泌型重組酵母表達(dá)載體pGAPZαA－F。酶切線性化后，經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞X－33，經(jīng)Zeocin抗性篩選，得到陽性轉(zhuǎn)化子。表達(dá)產(chǎn)物的上清液經(jīng)SDS－PAGE電泳和質(zhì)譜分析，表明在酵母中成功表達(dá)fortilin。以體外原代培養(yǎng)的對蝦血細(xì)胞檢測重組蛋白的免疫活性，結(jié)果顯示重組蛋白顯著提高了血細(xì)胞酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性。該結(jié)果為下一步研究重組fortilin在對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

凡納濱對蝦；fortilin；畢赤酵母；血細(xì)胞；免疫

翻譯控制腫瘤蛋白（translationally controlled tumor protein，TCTP），是1種高度保守，大量表達(dá)的真核蛋白，最初在小鼠艾氏腹水腫瘤細(xì)胞和紅白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)［1－2］。Gross等將其命名為“翻譯控制腫瘤蛋白”，是因?yàn)檫@種蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量要高于正常細(xì)胞，并且蛋白表達(dá)在翻譯水平上受到高度的調(diào)控［3］。Li等把在人類中發(fā)現(xiàn)的1種TCTP命名為fortilin，是一類新的抗凋亡蛋白質(zhì)［4］。研究表明，翻譯控制腫瘤蛋白fortilin具有重要的生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和惡性轉(zhuǎn)移［5］、鈣結(jié)合功能［6－7］、細(xì)胞外組胺釋放活性［9－11］、抗凋亡［4］及抗瘧疾作用［12］等。

迄今為止已克隆得到多種對蝦的TCTP／fortilin基因，包括斑節(jié)對蝦Penaeus monodon、凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei、日本囊對蝦Marsupenaeus japonicus和中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis等［13－15］。研究表明，對蝦fortilin具有相似的鈣結(jié)合以及抗凋亡活性，并且，fortilin參與對蝦抗病毒反應(yīng)，能夠保護(hù)對蝦抵抗病毒感染［15－17］。然而，這些結(jié)果都是在“離體”研究或者是通過肌肉注射fortilin的實(shí)驗(yàn)中得到的。在對蝦的集約化養(yǎng)殖中，通過口服（飼料）途徑導(dǎo)入活性制劑是1種高效、可行和節(jié)約成本的方式。為了實(shí)現(xiàn)在對蝦飼料中的應(yīng)用，批量制備fortilin及其制劑是必備的基礎(chǔ)條件。

本研究擬構(gòu)建凡納濱對蝦fortilin分泌表達(dá)載體，并探索在畢赤酵母Pichia pastoris中的表達(dá)。同時，分析表達(dá)物對血細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響，為進(jìn)一步研究fortilin的功能，以及開發(fā)重組fortilin酵母工程菌株應(yīng)用于對蝦飼料提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物材料 凡納濱對蝦，購于青島寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司，暫養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)，選取體長8.0～10.0cm的健康對蝦為材料。

1.1.2 質(zhì)粒與菌種 表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA和畢赤酵母X－33（Invitrogen）由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所宋曉玲研究員惠贈。E.coli Competent Cells DH5α購自TaKaRa公司。

1.1.3 試劑 PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶，Pyrobest高保真DNA聚合酶，T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶EcoR I，XbaI，BlnI（AvrII），核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000），低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，DNA凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒純化試劑盒等均購自TaKaRa公司。Trizol試劑、博來霉素（Zeocin）購自Invitrogen公司。酵母提取物、蛋白胨和瓊脂為BBI公司產(chǎn)品。葡萄糖為AMRESCO公司產(chǎn)品。Leibovitz’s L－15培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.4 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank的凡納濱對蝦fortilin基因序列（GenBank ID：DQ231062）設(shè)計引物fortilin－F、Fortilin－R，并依據(jù)pGAPZαA載體上的酶切位點(diǎn)以及fortilin基因序列的酶切特性，分別在正向引物中引入限制性內(nèi)切酶EcoRI識別位點(diǎn)（GAATTC），在反向引物引入限制性內(nèi)切酶Xba識別位點(diǎn)（TCTAGA），引物（5′－3′）序列如下：Fortilin－F：CCGGAATTCATGAAG GTCTTCAAGGACATGCTCACAGGT，F(xiàn)ortilin－R：GCTCTAGATTATAGCTTCTCCTCTGTTAGACCGTATTTTGG。另外，按照Invitrogen公司pGAPZ手冊提供的引物序列（5′－3′），合成一對載體引物pGAP－F：GTCCCTATTTCAATCAATTGAA，3′AOX1：GCAAATGGCATTCTGACATCC，以上引物均由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Fortilin基因的PCR擴(kuò)增 取凡納濱對蝦肝胰臟，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以引物對Fortilin－F／Fortilin－R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積50μL，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s、57.5℃退火30s、72℃延伸1min，32個循環(huán)，72℃延伸10min。使用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的基因片段。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 對空質(zhì)粒載體和fortilin基因PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行EcoRI和XbaI雙酶切，切膠純化后T4DNA連接酶于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，在含25μg／mL Zeocin的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆，并選取陽性克隆委托上海博尚生物技術(shù)有限公司測序，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pGAPZαA－F。

1.2.3 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母 純化重組質(zhì)粒pGAPZαA－F及空質(zhì)粒pGAPZαA，BlnI酶切使之線性化。參照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊制備酵母X－33感受態(tài)細(xì)胞。線性化質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化酵母，涂布Zeocin（100μg／mL）抗性YPDS平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取酵母基因組DNA，以引物對pGAP－F／3′AOX1進(jìn)行PCR鑒定，陽性重組酵母命名為X－33／pGAPZαAF，轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒pGAPZαA的酵母作為對照。

1.2.4 重組子X－33／pGAPZαA－F的表達(dá)與分析 挑取重組酵母單克隆至10mL YPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩過夜培養(yǎng)。取0.1mL過夜培養(yǎng)物接種至50 mLYPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)72h。培養(yǎng)物13 500r／min離心2min，收集上清進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測，表達(dá)蛋白委托廣州慧晶生物科技有限公司進(jìn)行串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分析進(jìn)一步鑒定。

1.2.5 凡納濱對蝦血細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取健康凡納濱對蝦，75%酒精消毒體表，用1mL注射器吸取抗凝劑（10mmol／L EDTA Na2，450mmol／L NaCl，10 mmol／L KCl，10mmol／L HEPES，pH＝7.3，調(diào)節(jié)滲透壓至850mOsm／kg）［18］，等比從對蝦腹血竇抽取血淋巴。400r／min離心10min，用培養(yǎng)基重懸血細(xì)胞，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，28℃恒溫培養(yǎng)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為2×Leibovitz's L－15，并添加20%胎牛血清，100IU／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素。

1.2.6 重組表達(dá)產(chǎn)物對血細(xì)胞免疫活性的檢測 重組子表達(dá)上清液真空冷凍干燥以進(jìn)行活性檢測，同時空質(zhì)粒重組子酵母培養(yǎng)上清液同樣冷凍干燥作為對照處理，重組子X－33／pGAPZαA－F及空質(zhì)粒酵母上清液凍干粉分別命名為F和P。血細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁，然后分別加入100、200、500μg／mL的F和P，繼續(xù)孵育24h。每個濃度設(shè)置4個重復(fù)。同時，以相同體積的培養(yǎng)基作為對照。樣品孵育后的血細(xì)胞一部分直接進(jìn)行呼吸爆發(fā)活性檢測，另一部分收集后0℃超聲破碎，5 000r／min離心10min，上清用于免疫酶活檢測。

呼吸爆發(fā)活性：參考Song等的方法［19］，血細(xì)胞中加入100μL 0.3%NBT，37℃溫育30min，溫育結(jié)束，560r／min，4℃離心10min，去除上清，加入200μL純甲醇終止反應(yīng)。10min后，700r／min，4℃離心10min，去除上清，70%甲醇洗滌3次，離心去除上清后，室溫晾干。干燥后，加入120μL 2mol／L KOH和140μL DMSO，充分溶解，測定溶液在波長630nm下的吸光值。呼吸爆發(fā)活性表示為OD630。

酚氧化酶活性：參考Hernández－López等的方法略作改動［20］。取50μL上述血細(xì)胞上清液與50μL胰蛋白酶溶液（0.1mg／mL溶于CAC緩沖液）（CAC緩沖液：10mmol／L二甲胂酸鈉10mmol／L CaCl2，pH＝7.0）加入96微孔板中，室溫下溫育10min，然后加入50μL L－DOPA溶液（3mg／mL溶于CAC緩沖液），室溫下溫育10min后，立刻放入酶標(biāo)儀中，在492nm波長下測定酶活動力學(xué)。以實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘每毫升血細(xì)胞上清液OD492增加0.001為1個酶活力單位。

超氧化物歧化酶（SOD）活性和一氧化氮合酶（NOS）活性均使用南京建成試劑盒測定。SOD活性定義為每mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位；NOS酶活力定義為每mL樣品每分鐘生成1nmol NO為1個酶活力單位。

1.2.7 統(tǒng)計分析 用SPSS統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)各處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，當(dāng)不同處理之間存在顯著差異（P＜0.05）時，采用Tukey多重比較。所有數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒鑒定

以凡納濱對蝦肝胰腺cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得507bp左右的預(yù)期條帶（見圖1），經(jīng)與質(zhì)粒載體pGAPZαA雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性轉(zhuǎn)化子測序，結(jié)果表明，閱讀框插入正確，無移碼錯配，即組成型重組表達(dá)載體pGAPZαA－F構(gòu)建成功。

圖1 凡納濱對蝦fortilin基因電泳圖Fig.1 PCR amplification of fortilingene of Litopenaeus vannamei

2.2 重組酵母表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE檢測

選擇陽性酵母菌株的發(fā)酵上清進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果如圖2所示。對比空載質(zhì)粒的酵母發(fā)酵上清，重組酵母發(fā)酵上清中明顯存在大小約為30KDa目的蛋白電泳條帶。進(jìn)一步的質(zhì)譜鑒定得到fortilin陽性肽段序列，由此說明fortilin在畢赤酵母中成功表達(dá)并分泌到發(fā)酵上清中。

圖2 重組酵母發(fā)酵上清的SDS－PAGE電泳Fig.2 SDS－PAGE analysis of fusion protein expression in P.pastoris

2.3 重組蛋白免疫活性檢測

重組fortilin對凡納濱對蝦原代培養(yǎng)的血細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性、酚氧化酶、超氧化物歧化酶以及一氧化氮合酶活性產(chǎn)生了不同程度的影響（見表1）。各濃度重組fortilin對呼吸爆發(fā)活性和一氧化氮合酶活性均沒有顯著影響（P＞0.05）；與對照和空質(zhì)粒酵母組相比，100、500μg／mL重組fortilin顯著提高了血細(xì)胞酚氧化酶活性（P＜0.05）；3個濃度的重組fortilin處理組的血細(xì)胞超氧化物歧化酶活性顯著提高（P＜0.05），但200、500μg／mL處理組與相同濃度的空質(zhì)粒酵母組無顯著差異（P＞0.05）。

表1 不同濃度重組蛋白對凡納濱對蝦血細(xì)胞免疫活性的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）1Table 1 Effects of fusion proteins on immune responses of hemocytes of Litopenaeus vannamei（mean±S.E.）

3 討論

病害流行，尤其是病毒病的爆發(fā)給世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，抗病毒蛋白或多肽的研究和開發(fā)具有重要意義。Fortilin是1種多功能蛋白，參與多種細(xì)胞活動［5］。研究表明，fortilin的表達(dá)在受到白斑病毒刺激時發(fā)生上調(diào)［15］。并且，有學(xué)者利用昆蟲Sf9細(xì)胞研究了fortilin和病毒基因之間的相互作用，結(jié)果顯示fortilin抑制WSSV早期基因（DNA聚合酶基因）和晚期基因（VP15和VP28基因）的表達(dá)，表明fortilin通過Ca2＋信號和轉(zhuǎn)錄控制干擾WSSV增殖［21］。本研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了凡納濱對蝦fortilin的體外表達(dá)，為進(jìn)一步研究fortilin在對蝦體內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)。

Fortilin被證實(shí)可以引發(fā)嗜堿性白細(xì)胞組胺釋放，隨后研究表明，fortilin具有更廣泛的細(xì)胞因子樣活性，可促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞分泌IL－4、IL－8、IL－13等促炎性細(xì)胞因子［22－23］。Fortilin自身也可以被某些細(xì)胞因子誘導(dǎo)，同時也是1種B細(xì)胞生長因子，可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、抗體和干擾素的分泌，在哺乳動物的免疫系統(tǒng)中可能具有重要作用［24］。一般認(rèn)為包括對蝦在內(nèi)的甲殼動物不具備特異性免疫系統(tǒng)，而對蝦的防御反應(yīng)是由循環(huán)血細(xì)胞以及存在于或從細(xì)胞釋放到血漿中的多種因子的活性而產(chǎn)生的。因而，對蝦的血細(xì)胞既是細(xì)胞免疫的擔(dān)當(dāng)者，又是體液免疫因子的提供者。本研究以體外培養(yǎng)的凡納濱對蝦血細(xì)胞為模型研究了重組fortilin的免疫活性。結(jié)果表明，重組fortilin顯著提高了血細(xì)胞酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性。甲殼類動物的酚氧化酶原系統(tǒng)在異物識別等免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［20］，該系統(tǒng)被激活后可以促進(jìn)血細(xì)胞的吞噬，介導(dǎo)凝集和凝固，產(chǎn)生殺菌物質(zhì)，參與疾病抵抗［25］。對蝦超氧化物歧化酶活性與其免疫能力也有直接的關(guān)系，超氧化物歧化酶活性升高，能及時清除機(jī)體免疫壓力下產(chǎn)生的活性氧，從而保障免疫細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的動態(tài)平衡、信號的正常傳導(dǎo)及免疫相關(guān)基因的正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提高了對蝦對病原的抵抗能力［26］。因此，本研究認(rèn)為重組fortilin可能通過相關(guān)信號途徑激活酚氧化酶和超氧化物歧化酶，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。同時，本實(shí)驗(yàn)中fortilin處理組呼吸爆發(fā)和一氧化氮合酶活性較對照組均有升高趨勢，但沒有顯著差異，表明fortilin可能不參與活性氧生成途徑。揭示fortilin在對蝦體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的具體機(jī)制，對于利用fortilin有效增強(qiáng)對蝦免疫能力很有必要，值得進(jìn)一步的研究。

在實(shí)際生產(chǎn)中，人們更多的關(guān)注如何將相關(guān)研究轉(zhuǎn)化為方便可行的技術(shù)，應(yīng)用于對蝦養(yǎng)殖，以期控制對蝦各種疾病。研究者已經(jīng)進(jìn)行了多種應(yīng)用方式的嘗試，例如：中和抗體、重組蛋白疫苗、DNA疫苗等，但是這些研究大多是通過注射手段實(shí)現(xiàn)的。顯然，對于對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)而言，注射費(fèi)時費(fèi)力，而通過飼料途徑添加無疑是一種更好的選擇。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、遺傳穩(wěn)定性好、具備翻譯后加工修飾功能、自身分泌蛋白少以及易進(jìn)行高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，是1個被廣泛應(yīng)用的高效真核表達(dá)系統(tǒng)。本研究成功構(gòu)建了fortilin重組質(zhì)粒，并實(shí)現(xiàn)了其在酵母的分泌表達(dá)，為fortilin作為飼料添加劑在對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。今后將進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件以提高重組蛋白產(chǎn)量，并通過養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)評估其免疫促進(jìn)特性和抗病功能。

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Secretion Expression of Fortilin in Yeast Pichia pastoris and Its Effects on Immune Responses of Hemocytes in White Shrimp Litopenaeus vannamei

ZHOU Yi，ZHANG Wen－Bing，MAI Kang－Sen
（The Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Fortilin is a multifunctional protein involved in important cellular activities.In addition，shrimp fortilin may interfere with viral infection，probably by inhibiting viral replication.The fortilin coding sequence（GenBank ID：DQ231062）was amplified by PCR from shrimp（Litopenaeus vannamei）hepatopancreas cDNA.The purified PCR fragments were cloned into the EcoR I／Xba I sites of the pGAPZαA vector.Sequences analysis verified whether the target genes were correctly inserted in right reading frame.The construct was linearized and was integrated into the yeast Pichia pastoris X－33by electroporation under the selection of Zeocin.The expressed proteins were identified by SDS－PAGE and characterized by matrix－assisted laser desorption ionisation－time of flight mass spectrometry（MALDITOF MS）.Then the culture supernatants of recombinant yeasts were lyophilized for analysis of immune responses of cultured hemocytes of white shrimp.Results showed that Fortilin fusion proteins significantly improved the activities of phenoloxidase and superoxide dismutase of cultured hemocytes.The present study made the first step for application of Fortilin protein in shrimp feeds.

Litopenaeus vannamei；fortilin；Pichia pastoris；hemocytes；immunity

S945.1

A

1672－5174（2012）1－2－54－05

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201103034）資助

2011－03－22；

2011－04－27

周 怡（1982－），女，博士生。E－mail：zyjc1314＠yahoo.com.cn

＊＊通訊作者：E－mail：wzhang＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 王 莉