王大慶，羅清禮

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，四川 南充 637000;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院眼科，四川 成都 610000)

分泌性蛋白hk10在眼瞼基底細(xì)胞癌中的表達(dá)

王大慶1，羅清禮2

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，四川 南充 637000;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院眼科，四川 成都 610000)

目的:研究在眼瞼基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma，BCC)中NES1基因的分泌蛋白(human kallikrein 10，hk10)的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與表型之間的關(guān)系，從蛋白水平上研究NES1在BCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。方法:采用免疫組化的方法檢測(cè)hk10在31例眼瞼BCC中表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與表型之間的關(guān)系，采用Image-Pro Plus5.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行掃描，定量分析hk10在不同組眼瞼BCC中的表達(dá)。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示hk10主要表達(dá)在細(xì)胞漿中，呈棕黃色。在正常眼瞼上皮組織中，hk10主要分布在上皮各層的鱗狀上皮細(xì)胞胞漿中，靠近基底細(xì)胞層表達(dá)稍強(qiáng);BCC原發(fā)組與BCC復(fù)發(fā)組在平均光密度上無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，在累積光密度(IOD)上，二者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BCC原發(fā)組具有較強(qiáng)的表達(dá)。結(jié)論:hk10在正常眼瞼上皮組織中高表達(dá)，在眼瞼基底細(xì)胞癌(BCC)中，hk10明顯表達(dá)下調(diào);NES1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的減少，可能在眼瞼BCC的復(fù)發(fā)中起一定作用;NES1作為一種新的抑癌基因，其可以作為眼瞼BCC的腫瘤分子標(biāo)記?！娟P(guān)鍵詞】NES1基因;抑癌基因;眼瞼基底細(xì)胞癌;分泌性蛋白hk10

基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma，BCC)是一種眼瞼最常見(jiàn)的惡性腫瘤，通常發(fā)生于暴露日光的皮膚，占所有眼瞼惡性上皮性腫瘤的80%～90%，近年來(lái)隨著人口的高齡化，BCC有逐漸增多的趨勢(shì)［1］。因此對(duì)BCC發(fā)病機(jī)制和治療的研究，一直是生物醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。BCC的病因至今尚不明了。其誘發(fā)因素與日光、紫外線、放射線、砷劑及遺傳等因素有關(guān)［2］。最近國(guó)外學(xué)者在研究乳腺癌和其他上皮性腫瘤中，發(fā)現(xiàn)了一種新的抑癌基因——正常上皮細(xì)胞特異性-1(normal epithelial cell specific-1，NES1)基因，又名激肽釋放酶10(KLK10)，是人類激肽釋放酶基因家族成員之一。其編碼蛋白序列與絲氨酸蛋白酶高度同源，在調(diào)控正常上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等方面中起一定作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)，NES1在許多上皮性腫瘤中表達(dá)缺失或下調(diào)，與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)甲基化是造成其表達(dá)缺失和下調(diào)的原因。我們采用免疫組化的方法檢測(cè)同屬上皮性腫瘤的眼瞼基底細(xì)胞癌(BCC)中NES1分泌蛋白hk10的表達(dá)情況，以期判斷NES1基因在眼瞼BCC中的表達(dá)情況并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

1.1.1 臨床資料收集了從2000至2005年間于華西醫(yī)院眼科住院部行眼瞼基底細(xì)胞癌手術(shù)切除的住院病人共31例，其中男性16例，女性15例，年齡21～79歲，平均53.11±0.85歲;右眼11例，左眼20例，上瞼8例，下瞼23例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)組(眼瞼BCC組):原發(fā)性BCC組(26例)和復(fù)發(fā)性BCC組(5例)。正常對(duì)照組:20例意外死亡后健康人的眼瞼上皮組織或距腫瘤邊界1 cm的正常皮膚組織。正常陽(yáng)性對(duì)照組:由于文獻(xiàn)顯示NES1在腺上皮中高表達(dá)，我們收到12例正常淚腺組織作為正常陽(yáng)性對(duì)照，以觀察NES1分泌的hk10在正常眼瞼上皮中的表達(dá)強(qiáng)度。

1.1.3 手術(shù)方式及組織處理冰凍切片顯微控制切除法或根據(jù)腫瘤的臨床分型距離腫瘤邊界3～5 mm常規(guī)切除腫瘤組織。標(biāo)本一式兩份，一份送常規(guī)病理檢查，一份置于凍存管內(nèi)，液氮速凍并于－80℃保存待用。所有病理切片均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的眼科病理專家聯(lián)合判讀。

1.2 主要試劑與儀器

羊抗人KLK10多克隆抗體(1∶400稀釋，Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))，抗羊S-P試劑盒，TE2000-U熒光相差倒置顯微鏡及顯微操作系統(tǒng)(Nikon公司，日本)，OLYMPUS DP70正置顯微鏡(Olympus公司，日本)，Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國(guó))，ZD-9556水平搖床，C5325切片機(jī)(Shan Don公司，德國(guó))，PHY-Ⅲ型病理組織漂烘處理儀(蘇州中威電子儀器廠，中國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將石蠟包埋的正常表皮及腫瘤組織塊切取石蠟切片，采用鏈親合素(streptavidin，SP)法行免疫組織化學(xué)檢查，切片室溫下放置10 min，然后放37℃孵箱10 min，常規(guī)二甲苯脫蠟10 min×2，100%－100%－95%－80%梯度酒精脫水1 min，蒸餾水洗滌3 min×3，3%H2O2阻斷過(guò)氧化物酶，室溫孵育20 min，PBS充分洗滌3 min×3，微波行抗原修復(fù)處理，700 W，95℃，15 min，自然冷卻后PBS洗滌5 min×2，正常羊血清1∶20稀釋，覆蓋組織切片，37℃孵育20 min，濾紙吸去羊血清，直接加一抗(KLK10 1∶400)，37℃孵育20 min，4℃冰箱過(guò)夜，PBS充分洗滌5 min×2，滴加生物素標(biāo)定的抗羊二抗1∶200稀釋，100 μL，37℃孵育40 min，滴加SP 1∶200稀釋，100 μL，37℃孵育30 min，滴加新鮮配制的DAB顯色液，室溫下5～10 min，顯微鏡下觀察，呈棕黃色顆粒，顯色適中，終止顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染3 min，室溫約4～5 min，反藍(lán)15 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。常規(guī)以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷和圖像處理

免疫組織化學(xué)染色切片用Image-Pro Plus5.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(20×10)，分別記錄目標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞染色反應(yīng)強(qiáng)度的IOD值(integrated optical density，累積光密度)和平均光密度值density(mean)，并算出它們的平均值，得到每個(gè)切片的IOD值和平均光密度值，最后把所有切片的光密度值分組歸類，并作統(tǒng)計(jì)分析。以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5%為陽(yáng)性表達(dá)。IOD值和density(mean)值與組織染色強(qiáng)度成正比。IOD=density(mean)×Area。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。采用t檢驗(yàn)來(lái)分析各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的光密度值，根據(jù)光密度值的大小來(lái)判斷hk10表達(dá)的強(qiáng)弱。設(shè)定P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hk10免疫組化檢查結(jié)果

采用SP法，DAB染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NES1的分泌性表達(dá)蛋白hk10主要表達(dá)在細(xì)胞漿中，呈棕黃色。在正常眼瞼上皮組織中，我們可以看到hk10主要分布在上皮各層的鱗狀上皮細(xì)胞胞漿中，靠近基底細(xì)胞層表達(dá)稍強(qiáng)(圖1，圖2)，而在正常淚腺組織中，其高表達(dá)于導(dǎo)管和腺泡小葉的立方柱狀上皮細(xì)胞胞漿中，在導(dǎo)管中也可見(jiàn)其分泌的hk10表達(dá)(圖3，圖4)。在BCC各組中，hk10明顯表達(dá)下降(圖5～圖14)。

2.2 免疫組化表達(dá)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 定性分析20例正常眼瞼上皮組織和12例正常淚腺組織(正常陽(yáng)性對(duì)照組)中均檢測(cè)到hk10的陽(yáng)性表達(dá)。31例BCC中有18例檢測(cè)到hk10陽(yáng)性表達(dá)，有13例hk10表達(dá)陰性或呈極弱陽(yáng)性。

2.2.2 定量分析采用Image-Pro Plus5.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(20×10)，分別記錄目標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞染色反應(yīng)強(qiáng)度的IOD值和平均光密度值，并算出它們的平均值，得到每個(gè)切片的IOD值和平均光密度值，最后把所有切片的光密度值分組歸類，并作統(tǒng)計(jì)分析，得到如下幾組數(shù)據(jù)(表1):可以看到BCC組與正常對(duì)照組比較，表達(dá)下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。正常對(duì)照組與正常陽(yáng)性對(duì)照組的表達(dá)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，正常陽(yáng)性對(duì)照組的表達(dá)更強(qiáng)。BCC原發(fā)組與BCC復(fù)發(fā)組在平均光密度上無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，在累積光密度(IOD)上，二者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BCC原發(fā)組具有較強(qiáng)的表達(dá)。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組免疫組化染色的光密度值比較(x－±s)

3 討論

正常上皮細(xì)胞特異性-1基因(normal epithelial cell specific-1，NES1)，是人類激肽釋放酶基因家族的成員之一?；蜷L(zhǎng)約5.5 kb，位于染色體19q13.3，有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子［4］。NES1編碼276個(gè)氨基酸，分子量約為30.14 kD，其蛋白序列類似于絲氨酸蛋白酶，是一種分泌蛋白，由于其基因產(chǎn)物序列與人類激肽釋放酶家族的其它成員和PSA(前列腺特異抗原)有著50～60%的同源性和34%～42%同一性，它又位于19號(hào)染色體q 13.3激肽釋放酶位點(diǎn)內(nèi)，因此，NES1又被命名為激肽釋放酶10(Kallikrein 10)。盡管與己知的絲氨酸蛋白酶序列有著高度的相似，但大量生化實(shí)驗(yàn)顯示NES1不具有蛋白酶功能，而具有潛在的分化功能，可能與NES1氨基酸末端不同尋常的結(jié)構(gòu)有關(guān)，通常大多數(shù)有活性的絲氨酸蛋白酶的末端氨基酸為鹽橋形成所必需的IVGG序列，而研究發(fā)現(xiàn)NES1氨基酸末端序列為L(zhǎng)DPEAY［5］。NES1的mRNA在許多組織器官中都有表達(dá)，特別是帶腺體的上皮細(xì)胞是其表達(dá)的主要位點(diǎn)。2002年，Petraki等［6］通過(guò)免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，NES1的表達(dá)通常在細(xì)胞漿，并且非器官特異性，其中代表性的器官有:乳腺、前列腺、卵巢、腎臟、睪丸、附睪、子宮內(nèi)膜、輸卵管、胃腸道、氣管、唾液腺、膽道、膽囊。脈絡(luò)膜叢上皮、周圍神經(jīng)和一些神經(jīng)內(nèi)分泌器官?gòu)浡缘貜?qiáng)表達(dá)這種蛋白。

NES1作為一種新的抑癌基因，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越引起人們的重視，國(guó)外在乳腺癌和其他一些生殖腺腫瘤中的研究顯示，NES1的mRNA和表達(dá)蛋白在許多腫瘤中表達(dá)下降或缺失，其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)腫瘤患者的早期診斷、估計(jì)預(yù)后等方面具有重要作用。Dhar等［7］采用原位雜交的方法檢測(cè)了136例不同乳腺組織樣本中NES1mRNA的表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)在全部30例正常乳腺組織和36例(75%)乳腺導(dǎo)管典型和不典型增生樣本中NES 1均呈高表達(dá);其余12例(25%)乳腺導(dǎo)管典型和不典型增生樣本中NES1表達(dá)降低;28例導(dǎo)管原位癌樣本中13例(46%)NES1表達(dá)缺失，其余15例(54%)NES1表達(dá)降低;而29例(97%)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌樣本NES1表達(dá)缺失，僅1例(3%)NES1呈弱表達(dá)。因此認(rèn)為，NES1mRNA在正常乳腺組織和良性病變中正常表達(dá)，在乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中NES1表達(dá)缺失，并且NES1的表達(dá)可作為乳腺癌進(jìn)展研究中的一個(gè)分子標(biāo)志物。為探討NES1基因的表達(dá)缺失是否可作為乳腺癌發(fā)病中的一個(gè)早期指標(biāo)，Yunes等［8］采用原位雜交方法研究了29例在診斷性活檢中確診為導(dǎo)管原位癌的樣本中NESl mRNA的表達(dá)與這些病例在行進(jìn)一步手術(shù)后的病理診斷之間的關(guān)系。結(jié)果6例活檢組織中有NES1表達(dá)的患者無(wú)1例最終被診斷為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，而在NES1表達(dá)缺失的病例中有40%的患者最終被發(fā)現(xiàn)為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，并且在NES1表達(dá)缺失，組織學(xué)分級(jí)為低-中分化的導(dǎo)管原位癌組中83%的病例被診斷為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，而在高分化組，僅24%的病例為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。結(jié)果提示，在導(dǎo)管原位癌病例中NES1表達(dá)缺失預(yù)示著浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的高危性，NES1表達(dá)的預(yù)測(cè)價(jià)值與低-中分化導(dǎo)管原位癌相關(guān)性更強(qiáng)。Goyal等［5］研究顯示NES1 mRNA及其表達(dá)蛋白在大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯降低或完全缺失，將NES1基因轉(zhuǎn)染到惡性程度高的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中后，可降低其惡性表型，將經(jīng)NES1轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞接種至裸鼠體內(nèi)，觀察到腫瘤生長(zhǎng)被抑制了。因而提示，NES1基因可作為一種腫瘤抑制基因和分子標(biāo)志物，其表達(dá)失活可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。文獻(xiàn)顯示在卵巢癌、睪丸癌和前列腺癌中也有相似情況［9－11］。

我們的研究顯示，20例正常眼瞼和12例正常淚腺組織中hk10強(qiáng)表達(dá)，并主要表達(dá)在細(xì)胞漿中，呈棕黃色。在正常眼瞼上皮組織中，我們可以看到hk10主要分布在上皮各層的鱗狀上皮細(xì)胞胞漿中，靠近基底細(xì)胞層表達(dá)稍強(qiáng)(圖2)，而在正常淚腺組織中，其高表達(dá)于導(dǎo)管和腺泡小葉的立方柱狀上皮細(xì)胞胞漿中，在導(dǎo)管中也可見(jiàn)其分泌的hk10表達(dá)(圖4)。在正常眼瞼上皮組織中hk10表達(dá)強(qiáng)度與正常淚腺組織相比相對(duì)較弱，正常淚腺的IOD值和平均光密度值都比正常眼瞼上皮組織高，這也再次證實(shí)了腺上皮是其高表達(dá)位點(diǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［6］。

在31例眼瞼BCC中有18例檢測(cè)到hk10陽(yáng)性表達(dá)，有13例hk10表達(dá)陰性或呈極弱陽(yáng)性。BCC組與正常對(duì)照組比較，表達(dá)下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(表1)。為了研究NES1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，我們?cè)O(shè)立了BCC原發(fā)組和BCC復(fù)發(fā)組，免疫組化顯示二者在累積光密度(IOD)上有顯著差異(P＜0.01)，原發(fā)組明顯高于復(fù)發(fā)組。在平均光密度上二者無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。這說(shuō)明在單個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)上二者無(wú)差異，但原發(fā)組有更多表達(dá)hk10的陽(yáng)性細(xì)胞。這提示我們BCC的復(fù)發(fā)可能與NES1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的減少有著密切的關(guān)系。

NES1基因在眼瞼BCC中表達(dá)的明顯下調(diào)，說(shuō)明作為一種新的抑癌基因，NES1可以作為一種分子標(biāo)記，其與眼瞼BCC的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，但能否作為一種早期診斷和預(yù)后的指標(biāo)，我們的樣本量還相對(duì)較少，要得到更有意義的結(jié)果，還需擴(kuò)大樣本，做更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

［1］Allali J，D＇Hermies F，Renard G.Basal cell carcinomas of the eyelids［J］.Ophthalmologica，2005，219(2):57－71

［2］Ducasse A，Pluot M，Gotzamanis A，et al.Factors of recurrence of basal cell carcinomas of the eyelid［J］.J Fr Ophtalmol.2002，25(5):512－516

［3］Luo L，Herbrick JA，Scherer SW，et al.Structural characterization and mapping of the normal epithelial cell-specificl gene［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，247(3):580－586

［4］Borgono CA，Michael IP，Diamandis EP.Human tissue kallikreins:physiologic roles and applications in cancer［J］.Mol Cancer Res，2004，2(5):257－280

［5］Goyal J，Smith KM，Cowan JM，et al.The role for NES1 serine protease as a novel tumor suppressor［J］.Cancer Res，1998，58(21):4782－4786

［6］Petraki CD，Karavana VN，Luo LY，et al.Human kallikrein 10 expression in normal tissues by immunohistochemistry［J］.J Histochem Cytochem，2002，50(9):1247－1261

［7］Dhar S，Bhargava R，Yunes M，et al.Analysis of normal epithelial cells pecific-1(NES1)/kallikrein 10m RNA expression by in situ hybridization，a novel marker for breast cancer［J］.Clin Cancer Res，2001，7(11):3393－3398

［8］Yunes MJ，Neuschatz AC，Bornstein LE，et al.Loss of expression of the putative tumor suppressor NES1 gene in biopsy-proven ductal carcinoma in situ predicts for invasive carcinoma at definitive surgery［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2003，56(3):653－657

［9］Luo LY，Katsaros D，Scorilas A，et al.The serum concentration of human kallikrein 10 represents a novel biomarker for ovarian cancer diagnosis and prognosis［J］.Cancer Res，2003，63(4)，807－811

［10］Oikonomopoulou K，Scorilas A，Michael IP，et al.Kallikreins as Markers of Disseminated Tumour Cells in Ovarian Cancer-A Pilot Study［J］.Tumour Biol，2006，27(2):104－114

［11］Sidiropoulos M，Pampalakis G，Sotiropoulou G，et al.Down－regulation of human kallikrein 10(KLK10/NES1)by CpG island hypermethylation in breast，ovarian and prostate cancers［J］.Tumour Biol，2005，26(6):324－336

The study of human kallikrein 10 expession in eyelid basal cell carcinoma

WANG Da-qing1，LUO Qing-li2
(1.The Department of Ophthalmology of the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000;2.The Department of Ophthalmology of Huaxi Hospital of Sichuan University，Chengdu 610000，Sichuan，China)

Objective:To investigate the expression of human kallikrein 10 in eyelid basal cell carcinoma(BCC)，and analyze the correlation between its expression and the tumorigenic phenotype.In addition，to study the role of NES1 in oncogenesis and progression of eyelid basal cell carcinoma at the protein level.MethodsThe Study involved the expression of human kallikrein 10 in 31 cases of eyelid basal cell carcinoma by immuno－h(huán)istochemistry and analyzed the correlation between its expression and the tumorigenic phenotype at the protein level.Qquantificational analysis of the expression of hk10 in different groups was done by using Image-Pro Plus5.0 softwear.Results:The immuno histochemistry showed that the expression of hk10 is generally cytoplasmic.In normal eyelid skin，it expresses widely in the cytoplasmic of leprose epithelia.Near the basal cell，it expresses more intensely.It has no differentiation between the primary group and recurrence group in density(P＞0.05)，but in integrated optical density(IOD)，the differentiation has a statistical significance(P＜0.01).Conclusionhk10 has a higher expression in normal eyelid skin，but hk10 expression has a obviously decline in eyelid BCC.The positive expression cell decline maybe play a role in the recurrence of eyelid BCC.NES1 maybe serves as a novel tumor suppressor gene and molecular biomarker in eyelid BCC.

NES1 gene;Tumor suppressor gene;Eyelid BCC;Human kallikrein 10

1005-3697(2012)06-0571-06

R773.4

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.013

四川省教育廳基金(07ZC021)

2012-07-10

王大慶(1969－)，男，四川廣安人，副教授，博士，主要從事眼眶及眼表疾病的研究。E－mail:wdq11@sina.com

時(shí)間:2012-11-1217∶08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20121112.1708.012.html

(學(xué)術(shù)編輯:蘭長(zhǎng)駿)