杜志昭，陳海英

(1.福建漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000;2.福建莆田學(xué)院，福建 莆田 351100)

缺血-再灌注對股骨頭關(guān)節(jié)軟骨細胞分化及基質(zhì)穩(wěn)定性的影響

杜志昭1，陳海英2

(1.福建漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000;2.福建莆田學(xué)院，福建 莆田 351100)

目的:探討缺血-再灌注對股骨頭關(guān)節(jié)軟骨退行性變的影響。方法:建立髖關(guān)節(jié)缺血再灌注模型，大鼠隨機分為正常組、模型組。于術(shù)后不同時點取股骨頭關(guān)節(jié)軟骨進行蘇木精-伊紅染色觀察缺血-再灌注后股骨頭關(guān)節(jié)軟骨的病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)改變;利用Van Gieson膠原纖維染色法觀察膠原纖維沉積變化;觀察VEGFmRNA原位雜交表達。結(jié)果:關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)逐漸紊亂，再灌注后軟骨細胞明顯減少，差異均有顯著性意義(P﹤0.01)。結(jié)論:缺血-再灌注可加重股骨頭關(guān)節(jié)軟骨的損傷，細胞增殖活性下降及細胞環(huán)境不穩(wěn)定可能是缺血－再灌注早期股骨頭關(guān)節(jié)軟骨損傷的重要機制。

缺血-再灌注;關(guān)節(jié)軟骨;軟骨細胞;膠原纖維;VEGFmRNA;原位雜交

缺血性損傷是由急性血液供應(yīng)障礙而導(dǎo)致細胞壞死引起。臨床上發(fā)現(xiàn)當(dāng)缺血的關(guān)節(jié)軟骨恢復(fù)血液供應(yīng)后，關(guān)節(jié)軟骨損傷卻仍在繼續(xù)，并且有加重的現(xiàn)象，即缺血－再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷。I/R是血供重新恢復(fù)后給機體帶來的進一步損傷，是骨科和創(chuàng)傷外科的研究熱點，目前對心、肝、脾、腎等臟器損傷研究較多，但對關(guān)節(jié)軟骨I/R損傷的研究很少，軟骨組織內(nèi)不含血管，不象其他器官容易遭受缺血的影響，使得I/R損傷的研究進展緩慢［1－4］。本文僅對I/R關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細胞及細胞環(huán)境的穩(wěn)定性進行研究探討，實驗從細胞增殖狀況、Van Gieson氏膠原纖維染色、VEGF原位雜交等代謝水平等觀察I/R關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細胞增殖及細胞分布、基質(zhì)代謝等方面對關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 建立大鼠股骨頭骨骺I/R損傷的動物模型

清潔級4月齡健康成年SD大鼠，體重200～220 g，購自福建醫(yī)科大學(xué)動物室(動物合格證號:閩實動質(zhì)準第2002－0006號)。雌雄不拘，塑料代謝籠分籠、普通塊料飼養(yǎng)，飲自來水。將大鼠隨機分為正常組(CON)10只;模型組(DM)20只。采用髂總動脈阻斷開放法建立大鼠股骨頭骨骺I/R模型:分離髂總動脈，在兩側(cè)髂總動脈分叉處以下用無創(chuàng)血管夾夾閉左側(cè)髂總動脈，到達再灌注時間點后松開血管夾，分別記錄缺血和再灌注時間。2組分別在缺血5 h、24 h組再灌注，每組在再灌注后即刻、24 h、168 h分批麻醉下處死實驗大鼠，每組每個時間點6只，正常組在實驗條件下即刻處死動物取標本，實驗中標本均取自實驗側(cè)。將標本分為2份。

1.2 關(guān)節(jié)軟骨標本的制備，組織學(xué)觀察及圖像分析

標本放入4%多聚甲醛溶液中固定24～36 h，逐級脫水脫脂后，再以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，石蠟包埋切片，酸處理、烘干后用多聚賴氨酸包被干燥，觀察軟骨細胞與細胞外基質(zhì)分布。

1.3 關(guān)節(jié)軟骨組織計量學(xué)指標比較

關(guān)節(jié)軟骨切片在普通顯微鏡下，進行軟骨細胞密度測定:鏡下計算每1 mm×1 mm關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細胞的數(shù)量。同樣要求在不同10個視野各測定一次，取平均值。

1.4 Van Gieson氏膠原纖維染色

關(guān)節(jié)軟骨脫鈣，包埋、切片，以Van Gieson氏進行膠原纖維染色，光鏡下觀察膠原纖維沉積情況。選擇有意義的組織相片，經(jīng)登錄、編號、采集、分析、讀取數(shù)據(jù)、存盤。在每張切片關(guān)節(jié)軟骨下區(qū)各隨機選10個視野測定，用圖像分析儀測定單位面積內(nèi)膠原纖維沉積情況。

1.5 VEGF原位雜交表達

按照VEGFmRNA寡核苷酸探針雜交試劑盒(武漢博士德)，具體步驟操作，DAB顯色、蘇木素復(fù)染;顯微鏡觀察，圖象分析。探針序列(河北博海公司提供):5'-GCTCT ACCTC CACCA TGCCA AGTGG TCCCA-3'，5'-GACCC TGGTG GACAT CTTCC AGGAG TACCC-3'，5'-GCAGC TTGAG TTAAA CGAAC GTACT TGCAG-3'陰性對照:原位雜交過程用預(yù)雜交液替代探針工作液，其余步驟同上雜交試劑盒。光鏡下選擇生長板結(jié)構(gòu)進行觀察。

光鏡下分別選擇股骨頭關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)進行觀察、照相、編號、采集、分析存盤。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析測定和計量數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行，采用兩個獨立樣本t檢驗，比較組間差異，P﹤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均用均值±標準差±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 HE染色關(guān)節(jié)軟骨病理組織學(xué)改變

正常組關(guān)節(jié)軟骨較厚，軟骨細胞清晰(圖1)。I/R早期關(guān)節(jié)腫脹，滑膜在關(guān)節(jié)緣粘連，軟骨表面失去光澤，彈性差。以再灌注168 h后較明顯。光鏡下所見:缺血期間關(guān)節(jié)滑膜水腫，少量炎細胞浸潤，再灌注后還可見細胞變性、壞死。單純?nèi)毖? h及24 h，缺血期間關(guān)節(jié)軟骨變化不明顯，以后隨著時間的延長部分軟骨細胞出現(xiàn)核碎裂。再灌注24 h后軟骨細胞輕度腫脹，排列疏松，細胞變性明顯。再灌注168 h骺板軟骨細胞較多核碎裂，并部分核溶解。再灌注后24 h、168 h(圖2)和再灌注后即刻比較，其軟骨細胞密度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)(圖3)。

2.2 Van Gieson氏膠原代謝結(jié)果

正常組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細胞間質(zhì)染色較淺，膠原纖維均勻分布，排列方向有序(圖4)。缺血5 h再灌注24 h后，觀察到關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，軟骨基質(zhì)膠原纖維增多。缺血24 h再灌注后24 h、168 h其軟骨細胞間質(zhì)染色較深，膠原纖維增多(圖5)，和再灌注后即刻、正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)(圖6)。

2.3 VEGF原位雜交表達及灰度值結(jié)果分析

正常組VEGFmRNA主要表達在關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細胞中，表現(xiàn)為軟骨細胞胞漿和胞膜著色，DAB顯色為棕黃色(圖7)。缺血5 h再灌注24 h后，觀察到VEGFmRNA表達的陽性細胞數(shù)增多。缺血24 h再灌注后24 h、168 h其VEGFmRNA表達的陽性細胞數(shù)增多、增強(圖8)。與再灌注后即刻、正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)(圖9)。

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷后同其他組織損傷一樣，出現(xiàn)梗死面積和血流動力學(xué)指標及活性物質(zhì)釋放的改變［5－8］，面臨重建問題。當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨缺血性損傷發(fā)生時，一方面要實施恢復(fù)血流的再灌注，另一方面還要考慮到因再灌注而造成的細胞增殖能力下降。缺血10 h再灌注168 h，關(guān)節(jié)軟骨細胞則可發(fā)生核碎裂;當(dāng)缺血24 h再灌注168 h時，關(guān)節(jié)軟骨細胞則可發(fā)生核溶解。這一結(jié)果初步表明，I/R可引起骨細胞的損傷，同時隨著I/R時間的延長，關(guān)節(jié)軟骨細胞的損傷逐漸加重，軟骨細胞僅維持較低水平的新陳代謝。關(guān)節(jié)軟骨細胞的營養(yǎng)與軟骨基底的血供有關(guān)［9］，關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)來源只有靠關(guān)節(jié)液來維持，與其他組織I/R比較，軟骨細胞的易損性明顯增加。關(guān)節(jié)I/R損傷時關(guān)節(jié)軟骨損害的具體機制目前不確切，可能當(dāng)關(guān)節(jié)缺血后，關(guān)節(jié)滑膜和軟骨下供血障礙，導(dǎo)致軟骨的營養(yǎng)及代謝失調(diào)，打破了軟骨合成和分解之間的平衡，使關(guān)節(jié)軟骨的分解代謝大于合成代謝。而滑膜的缺血更加影響了滑液的分泌，進一步加重了軟骨的損傷。同時肢體I/R損傷時可以產(chǎn)生大量的氧自由基、炎性細胞因子(白細胞介素1、腫瘤壞死因子α)等［10－11］。軟骨明顯增厚也是一種損傷表現(xiàn)，可能因股骨頭軟骨靠關(guān)節(jié)液營養(yǎng)的同時也因軟骨下血管受缺血再灌注損傷有關(guān)。

另本實驗中膠原纖維沉積增多，這可能是實驗中未發(fā)現(xiàn)軟骨細胞增生修復(fù)、而促進軟骨細胞內(nèi)氨基酸蓄積，刺激骨膠原合成。這可能與觀察時間太短有關(guān)，即后期表現(xiàn)為膠原等細胞外基質(zhì)成分表達的減少，這些問題有待于進一步研究。

VEGFmRNA是一種作用于動靜脈與淋巴管內(nèi)皮細胞的二聚糖蛋白類絲裂原，與組織損傷修復(fù)和功能恢復(fù)密切相關(guān)。VEGFmRNA作用的靶細胞關(guān)節(jié)軟骨細胞可以合成并表達VEGFmRNA。VEGFm-RNA是軟骨細胞生長活性可靠指標，能夠很好反映其所處的代謝狀態(tài)。VEGFmRNA表達趨勢完全能夠體現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細胞所合成分泌的VEGF的生物學(xué)效應(yīng)。缺血性損傷時體內(nèi)代謝紊亂和糖毒作用，組織廣泛缺血缺氧，導(dǎo)致多種細胞因子和生長因子可上調(diào)VEGFmRNA水平或誘導(dǎo)VEGF釋放。病程中持續(xù)高效地分泌VEGF、纖維蛋白等進入細胞外基質(zhì)，協(xié)同加快軟骨轉(zhuǎn)換。實驗說明在軟骨重建作用較強的組織中，軟骨細胞為適應(yīng)軟骨重建的需要而發(fā)生細胞增殖功能下降現(xiàn)象越明顯，并且在形態(tài)學(xué)、生化學(xué)及各種分子標記技術(shù)方面得到證實。軟骨組織通過某些基因，誘導(dǎo)和調(diào)控細胞增殖能力，使需要重建的軟骨細胞和骨基質(zhì)，達到一種最佳的平衡狀態(tài)以適應(yīng)機體活動的需要。

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Ischemia-reperfusion on femoral head articular cartilage cell differentiation and environmental stability

DU Zhi-zhao1，CHEN Hai-ying2
(1.Zhangzhou health Career Technical College，Zhangzhou 363000;2.Putian College，Putian 351100，F(xiàn)ujian，China)

Objective:TO study effect of ischemia-reperfusion by articular cartilage degeneration upon femoral-head.MethodsEstablish the hip joint of is chemia reperfusion model the rats.The rats were random divided into the normal groups and the model groups.In the postoperative time points From the articular cartilage of femoral head，Observe the structure of articular cartilage including cartilage cells，the change of collagen and the expression of VEGFmRNA by HE，Van Gieson，and in Situ Hybridization.ResultsThe model rats'articular cartilage developed with the course of illness，disordered structure，the cartilage cells became few and.small，fiber rose.The expression of VEGFmRNA reduced，the microvessel density enlarged.Conclusion:With the extension of the course，Ischemia reperfusion can exacerbate of articular cartilage of femoral head injury，Cell apoptosis and environmental instability may be ischemia reperfusion of early femoral head articular cartilage injury mechanism.

Ischemia reperfusion;Articular cartilage;Cartilage cells;Collagen;VEGFmRNA;In Situ Hybridization

1005-3697(2012)06-0562-04

R684

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.011

福建省教育廳科研項目(JB08222)

2012-10-12

杜志昭(1968－)，男，福建漳州人，講師。主要從事解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教學(xué)與科研工作。E-mail:chhyzw@163.com

時間:2012-11-1217∶34

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.201201112.1734.030.html

(學(xué)術(shù)編輯:謝勇恩)