何穎娜，尚京川，楊志強(qiáng)

(1.河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091;2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)和生物材料研究室，重慶 400016;3.河北瑞洲生物科技有限公司，河北 石家莊 050021)

高效液相色譜法快速測(cè)定腦梗塞模型大鼠腦組織中多胺的含量

何穎娜1，尚京川2△，楊志強(qiáng)*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091;2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)和生物材料研究室，重慶 400016;3.河北瑞洲生物科技有限公司，河北 石家莊 050021)

目的:建立一種簡(jiǎn)便、靈敏和快速分離測(cè)定大鼠腦組織中腐胺、精脒和精胺等多胺含量的高效液相色譜法。方法:采用苯甲酰氯作為衍生化試劑，以1，6-己二胺為內(nèi)標(biāo)，采用polygocyl(250×4.6 mm 5 μm)C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水(62:38 V/V)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)229 nm。結(jié)果:本法線性范圍是1～2 000/mL，回收率大于90%。日內(nèi)和日間變異系數(shù)為1.5%～4.2%。最低定量濃度為1 nmol/mL。結(jié)論:該方法符合生物樣品分析要求，為腦組織中多胺的含量測(cè)定提供了一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高的分析方法。

多胺;高效液相色譜;固相萃取

多胺(polyamines)是指以腐胺(putrescine)、精胺(spermine)和精瞇(spermidine)為代表的多個(gè)氨基的生物原物質(zhì)。多胺做為體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要物質(zhì)之一，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及組織的再生起著關(guān)鍵性作用。在多種病理情況下(如腫瘤、腦損傷等)，多胺的代謝可發(fā)生明顯的紊亂。近年來的研究表明:腦組織的中多胺代謝的紊亂與多種腦損傷有密切關(guān)系，且損傷的程度不同變化不一，因此可以作為腦損傷嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)［1］。為了探討腦梗塞后腦組織中多胺的含量變化，本文提出一種簡(jiǎn)便、靈敏、快速的多胺檢測(cè)方法，用于大鼠腦組織中多胺含量的測(cè)定，獲得滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

美國(guó)Angilent 1100高效液相色譜儀，UV 1100紫外檢測(cè)器，Model TJ-R離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)，QL-901漩渦混勻器(江蘇海門市琪琳醫(yī)用儀器廠)，固相萃取儀(美國(guó)安捷倫公司)，Bond-Elut C18固相萃取小柱(美國(guó)安捷倫公司)。腐胺、精胺和精瞇對(duì)照品(瑞士FluKa公司純度99.9%)、1，6-己二胺(色譜純)、苯甲酰氯(分析純)、甲醇(色譜純，美國(guó)天地公司)其余試劑均為分析純。

樣品收集方法:健康雄性Wistar大鼠40只，體重180～220 g(由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為對(duì)照組和腦梗塞組，腦梗塞組采用光化學(xué)誘導(dǎo)法制備大鼠局灶性腦梗塞模型。然后分別于梗塞后5 min、8 h、和24 h，將大鼠迅速斷頭處死，取梗塞周圍腦組織約100 mg，液氮中保存，待檢。對(duì)照組除不經(jīng)過光照處理造成腦梗塞之外，其他處理同腦梗塞組。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制對(duì)照品溶液:精密稱取腐胺、精瞇、精胺對(duì)照品8.8、14.7、20.2 mg(分別相當(dāng)于腐胺、精瞇、精胺100 mmol)，置100 mL量瓶中，以5%HClO4溶解并定容，得1.0 mmol/mL的多胺對(duì)照品溶液。

對(duì)照品工作液:依次用5%HClO4稀釋制成1、3、10、30、100、500、2 000 nmol/mL的多胺系列濃度對(duì)照品溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取1，6-己二胺對(duì)照品25.0 mg，置25 mL量瓶中，以5%HClO4溶解并定容，得1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液

內(nèi)標(biāo)工作液:再用5%HClO4稀釋成50 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2.2 組織樣品預(yù)處理取出液氮保存的腦組織，準(zhǔn)確稱量0.5 g，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL和5%HClO45 mL，冰浴下勻漿(3 000 r/min)1 min，離心(13 000 r/min 4℃)10 min，頃出上清液，沉淀部分加入等量5%HClO4，混勻后，離心(13 000 r/min 4℃)10 min，合并兩次提取液，加入等體積2.5 mol/LNaOH，待衍生。

1.2.3 衍生化反應(yīng)和固相萃取在待衍生溶液中加入苯甲酰氯7 μL，渦旋混勻，40℃水浴中反應(yīng)30 min，然后用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為7左右，加在C18固相萃取柱(預(yù)先用甲醇3 mL活化，3 mL水平衡)上，依次用15 mL雙蒸水、15 mL 15%甲醇和1 mL苯?jīng)_洗小柱，洗去極性雜質(zhì)，抽干，以0.5 mL甲醇洗脫待測(cè)組分，混勻后取100 μL進(jìn)行HPLC分析，以內(nèi)標(biāo)法定量。

1.2.4 色譜條件色譜柱:polygocyl C18(250×4.6 mm 5μm)(大連色譜中心填裝);流動(dòng)相:甲醇-水(62:38 V/V);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):229 nm;柱溫:25℃。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 多胺的色譜分離

多胺的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品按方法處理項(xiàng)操作，色譜圖見圖1，在此色譜條件下多胺分離較好，在線掃描顯示標(biāo)準(zhǔn)多胺和樣品多胺衍生物的紫外吸收光譜一致，最大吸收波長(zhǎng)(λ max)為229 nm，以此為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率及精密度

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線取系列腐胺、精瞇、精胺對(duì)照品溶液，按“樣品處理方法”項(xiàng)下操作，以多胺的峰高和內(nèi)標(biāo)峰高之比(Hi/Hs)為橫坐標(biāo)，以多胺的濃度(C)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法(1/c2)進(jìn)行回歸，得到腐胺、精瞇、精胺的回歸方程分別為:

腐胺:C1=0.03129+4.496 Hi1/Hs1r=0.9955;(n=6)

精瞇:C2=0.04789+4.591 Hi2/Hs2r=0.9996;(n=6)

精胺:C3=0.02321+5.495 Hi3/Hs3r=0.9993;(n=6)

結(jié)果表明:多胺的濃度在1～2 000 nmol/mL之間，C與Hi/Hs之間線性關(guān)系良好，最低定量限為1 nmol/mL。

2.2.2 回收率和精密度取多胺對(duì)照品溶液，加入內(nèi)標(biāo)溶液，按“樣品處理方法”項(xiàng)下操作，根據(jù)峰高比計(jì)算多胺在腦組織中的回收率，測(cè)得回歸率分別為:腐胺96.47%，精瞇95.39%，精胺92.11%(n=6)。

日內(nèi)誤差和日間誤差按回收率方法，對(duì)每個(gè)腦組織樣品分別在日內(nèi)各做5次，并在連續(xù)5d內(nèi)分別各做一次，測(cè)得日內(nèi)和日間精密度的變異系數(shù)在1.5%～4.2%之間。

2.3 大鼠腦組織中多胺的含量比較

采用本方法對(duì)和腦梗塞模型大鼠腦組織中多胺的含量進(jìn)行測(cè)定(表1)，結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，梗塞后8 h和24 h大鼠腦組織中腐胺的含量明顯增高(P＜0.05)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腦組織中多胺的含量有逐漸增高的趨勢(shì);而精胺和精瞇的含量雖然有較大程度的增高，但大多數(shù)沒有顯著性差異。

表1 大鼠腦組織多胺的含量(±snmol/g)

表1 大鼠腦組織多胺的含量(±snmol/g)

*:P＜0.05，與對(duì)照組相比。

對(duì)照組 29.39±3.14571.49±231.21359.12±130.06梗塞5 min943.98±11.09*1 867.02±798.251 120.74±377.4*梗塞8 h1056.97±16.85*1 107.92±577.50919.13±571.52梗塞24 h9337.09±79.74*6 1 064.66±576.631 031.18±434.38

3 討論

腦組織中生化的改變是反映神經(jīng)損傷的敏感指標(biāo)。其發(fā)生在損傷的早期和神經(jīng)組織發(fā)生形態(tài)學(xué)改變之前。生化改變是神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂的基礎(chǔ)。精瞇在體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)調(diào)控作用，促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖、生長(zhǎng)、穩(wěn)定細(xì)胞和亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)、調(diào)控體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)的生物合成、修飾蛋白激酶等，是評(píng)價(jià)腦組織發(fā)育的有用指標(biāo)。在動(dòng)物和人體內(nèi)鳥氨酸經(jīng)脫羧酶作用生成腐胺，腐胺再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成精瞇、精胺等。成年動(dòng)物腦中多胺的合成，在多種病理情況下會(huì)明顯增加，尤其是在不同的病理階段，多胺的合成對(duì)不同腦受損的應(yīng)激狀態(tài)這種敏感性，可作為腦損傷嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)［2－3］。本實(shí)驗(yàn)的研究顯示，缺血后腦組織中的腐胺含量明顯增加，并且隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，含量成倍增長(zhǎng)，提示腐胺的含量變化與缺血時(shí)間密切相關(guān)，而精胺和精瞇的變化卻不顯著。

多胺的測(cè)定方法可分成化學(xué)法和生物法兩類。雖然酶法和免疫法已有報(bào)道，但這些方法至今尚未完善。HPLC法具有分析速度快、檢測(cè)靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確的特點(diǎn)，是目前臨床疾病中多胺含量分析測(cè)定的主要手段。其中，反相高效液相色譜(RPHPLC)法被多數(shù)研究者選擇用于多胺的分離和定量分析。多胺在可見和紫外區(qū)域既沒有滿意的吸收，也沒有熒光成分，所以在采用HPLC測(cè)定時(shí)，一般需要對(duì)多胺進(jìn)行化學(xué)衍化處理。根據(jù)其所用檢測(cè)器的不同，可以將多胺的測(cè)定方法分為紫外檢測(cè)法，熒光檢測(cè)法以及電化學(xué)檢測(cè)法，熒光檢測(cè)法及電化學(xué)檢測(cè)法的靈敏度較紫外法高，但是熒光檢測(cè)法和電化學(xué)檢測(cè)法衍生反應(yīng)較慢，一般需要梯度洗脫，流動(dòng)相消耗較大且時(shí)間很長(zhǎng)，一般在40 min以上［4］，而紫外檢測(cè)法則具有衍生反應(yīng)迅速、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定且使用等度洗脫、所用時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，因此適用于多胺的快速測(cè)定。

本方法以苯甲酰氯作為衍生試劑，衍生反應(yīng)快速、穩(wěn)定，采用等度洗脫、紫外檢測(cè)。方法穩(wěn)定性好，分析時(shí)間在20 min內(nèi)，與熒光檢測(cè)或者電化學(xué)檢測(cè)法相比，分析時(shí)間大大縮短。

實(shí)驗(yàn)過程中采取直接稱取腦組織，加入內(nèi)標(biāo)，然后進(jìn)行勻漿的處理方法，不僅縮短前處理時(shí)間，還避免反復(fù)凍融腦組織樣品對(duì)多胺含量的影響，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性腦組織樣品經(jīng)低溫勻漿后，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后經(jīng)固相萃取，除去雜質(zhì)，即可進(jìn)行HPLC測(cè)定，前處理方法簡(jiǎn)便、快速，而且可以批量處理樣品，滿足腦組織中多胺快速測(cè)定的要求。

［1］Kim GH，Komotar RJ，McCullough-Hicks ME，et al.The role of polyamine metabolism in neuronal injury following cerebral ischemia［J］.Can J Neurol Sci，2009，36(1):14－19

［2］Li J，Doyle KM，Tatlisumak T.Polyamines in the brain:distribution，biological interactions，and their potential therapeutic role in brain ischaemia［J］.Curr Med Chem，2007，14(17):1807－1813

［3］Takano K，Ogura M，Nakamura Y，et al.Neuronal and glial responses to polyamines in the ischemic brain［J］.Curr Neurovasc Res，2005，2(3):213－223

［4］Fu S，Xiao C，Zhao W，et al.Polyamines analysis by HPLC and their application as tumor markers［J］.Front Biosci(Elite Ed)，2012，(4):1795－1801

Rapid high performance liquid chromatography assay of polyamines in rat brains

HE Ying-na1，SHANG Jing-chuan2△，YANG Zhi-qiang3
(1.Traditional Chinese Medical College，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，Hebei;2.Research Institute of Pharmic Chemistry and Biomaterials，Chongqing university of Medical Science，Chongqing 400016，Chongqing;3.Hebei Natural Co.Ltd.Shijiazhuang 050021，Hebei，China)

Objective:To develop a simple，sensitive and fast method for determination of putrescine，spermidine and spermine in mouse rat brains.MethodsWith the benzoyl chlorides as the derivation reagent and 1，6-Hexanediamine as the internal standard，the polyamines were separated on the polygocyl C18(250×4.6 mm 5μm)column using methanol-water(62:38 V/V)as the mobile phase(flow rate 1.0 mL/min)with UV detector at wavelength 229 nm.Results:The standard curve was linear in the content range 1－2000 nmol·mL－1.The recoveries were higher than 90%and the RSD was in the range from 1.5%to 4.2%.The low limits of quantification were one nmol/mL.Conclusion:The proposed method was suitable for screening polyamines in rat brains.

Polyamines;High performance liquid chromatography(HPLC);Solid-phase extraction(SPE)

1005-3697(2012)06-0538-04

R741

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.004

河北科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(11230908D-4-2)

2012-08-20

何穎娜(1977－)，女，醫(yī)學(xué)博士，講師，主要從事藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

△通訊作者:尚京川，E-mail:heyingna2002@163.com網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2012-11-1217∶14

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20121112.1714.020.html