賈媛媛，王紹慶，常廣軍，張源淑，莊蘇，倪迎冬，沈向真，陳杰，趙茹茜

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京210095）

隨著我國人民生活水平的改善，奶業(yè)在整個國民經(jīng)濟中的地位日益提高。但是，以秸稈為主要粗飼料時，大量飼喂高精料雖然在一定程度上提高了反芻動物的生產(chǎn)性能，卻極易引發(fā)瘤胃亞急性酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）。SARA是一種常見的代謝性疾?。?］，商業(yè)化奶牛養(yǎng)殖場中，有20%以上的奶牛在泌乳早期和泌乳中期患有SARA［2］，并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，造成了極大的經(jīng)濟損失［3］。SARA發(fā)生時瘤胃酸度和細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）濃度顯著增加，嚴(yán)重感染受損的瘤胃上皮［4，5］，LPS發(fā)生移位進入血液，形成內(nèi)毒素血癥［6，7］，引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)［8］。此外，機體免疫系統(tǒng)遭到損害，使動物處于一種慢性應(yīng)激狀態(tài)。目前，國內(nèi)外對SARA的研究多集中于瘤胃發(fā)酵模式和血液參數(shù)的改變，對應(yīng)激反應(yīng)的研究較少。Steiger等［9］和Waldron等［10］的相關(guān)研究指出，奶牛注射LPS后免疫細胞所釋放的細胞因子最終能激活下丘腦－垂體－腎上腺軸（hypothalamie－pituitary－adrenalaxis，HPA）。Niel等［11］研究表明，綿羊注射IL－6后外周血中促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇濃度均顯著升高，并將這2項指標(biāo)作為HPA軸激活的標(biāo)志。糖皮質(zhì)激素是體內(nèi)重要的應(yīng)激和代謝激素，對機體在正常和應(yīng)激，包括疾病和炎癥狀態(tài)下營養(yǎng)的重分配，能量平衡的維持以及在逆境下的生存起決定性的作用［12，13］。肝臟作為機體重要的代謝器官，肝臟上存在高豐度表達的糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR），能夠接受糖皮質(zhì)激素的信息并做出適應(yīng)調(diào)節(jié)［14］。但SARA狀態(tài)下HPA軸是否被激活及受體是否改變卻鮮有報道。本研究旨在模擬實際生產(chǎn)中的飼喂模式，通過添加高精料日糧誘導(dǎo)亞急性瘤胃酸中毒，初步揭示SARA時機體的應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)及肝臟上糖皮質(zhì)激素受體基因表達的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)

選用健康狀況良好、體重15～20kg的泌乳中期山羊（波爾山羊與浙江麗水本地山羊雜交后代）7只，手術(shù)安裝永久性瘤胃瘺管，恢復(fù)期為14d，2010年12月－2011年2月飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物房，單籠飼養(yǎng)，隨機分為2組，分別飼喂精粗比為4∶6和6∶4的日糧，自由飲水。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用2×2拉丁方設(shè)計，隨機分為2組（分別為3和4只），分別飼喂精粗比4∶6（對照組）和6∶4（SARA組）日糧（由羊草、苜蓿草和精料組成），粗料由20%苜蓿草和80%羊草組成，配方詳見表1。2組日糧總能量和總蛋白含量相等。試驗分為2期，每期包括適應(yīng)期14d和采樣期5d（適應(yīng)期和采樣期都飼喂相同的試驗日糧），第1期采樣結(jié)束后調(diào)換日糧。每日08：00和20：00各擠奶1次。

1.3 樣品采集處理與分析測定

1.3.1 瘤胃液采集和處理 采樣當(dāng)天，于飼喂前0 h，以及飼喂后1，2，4，6和10h通過瘤胃瘺管采集瘤胃液10mL（經(jīng)孔徑為0.15mm尼龍絹過濾），立即測定pH，然后裝入塑料離心管中，在4℃條件下，1 900 r／min離心30min，取上清，－20℃保存。

1.3.2 血液采集和處理 采樣前2d，在山羊頸靜脈處安裝血管瘺。分別于飼喂前0h、飼喂后6h經(jīng)頸靜脈血管瘺采集血液，裝入肝素鈉真空離心管中，4℃，3 500r／min離心15min，收集血漿，－20℃保存。

1.3.3 肝臟RNA的提取及 Real－time PCR 肝臟活體采樣，利用TRIZOL一步法提取肝臟樣品總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA的濃度和純度（OD260／280），變性瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA質(zhì)量，－70℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄酶體系及Tap酶為Promega產(chǎn)品，SYBR Green購自TaKaRa公司。GR和β－actin引物采用Primer 5.0軟件自行設(shè)計，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表2。

表1 試驗精料日糧組成Table 1 Composition of experimental diets

表2 目的基因引物序列Table 2 The primer sequences of the target genes

1.4 測定指標(biāo)

瘤胃液、血液內(nèi)LPS采用ELISA法測定，按試劑盒說明書操作進行，標(biāo)準(zhǔn)方程分別為：Y＝297.6 X＋14.52，R2＝0.994；Y＝301.1 X＋13.59，R2＝0.994，式中，X表示各樣品所測 OD值，Y表示各樣品對應(yīng) LPS含量（EU／L），R表示相關(guān)系數(shù)，LPS試劑盒購于上海朗頓生物科技有限公司。瘤胃液內(nèi)乳酸用比色法測定［15，16］，乳酸濃度＝（樣品OD值－空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度／（標(biāo)準(zhǔn)品OD值－空白OD值），乳酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所。血漿、瘤胃液皮質(zhì)醇濃度采用放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）法測定，測定方法按放免檢測藥盒說明書進行，試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所。以上試驗均重復(fù)2次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行單變量雙因素分析，主效應(yīng)分別為日糧處理和采樣時間；用ANOVA進行方差分析，采用多項式比較分析日糧處理的效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精粗比日糧對瘤胃液pH的影響

2種日糧飼喂條件下，瘤胃液pH動態(tài)變化趨勢基本一致（圖1）。瘤胃液pH在飼喂前最高，飼喂后隨時間延長，pH逐漸下降，隨后由于瘤胃本身的緩沖能力pH又逐漸上升。其中，SARA組山羊在飼喂后1h，pH開始低于5.8，一直持續(xù)到6h。飼喂后6hSARA組山羊瘤胃液pH顯著低于對照組（P＜0.05），飼喂后1，2和4hSARA組山羊瘤胃液pH極顯著低于對照組（P＜0.01）。日糧類型以及日糧類型與發(fā)酵時間互作效應(yīng)對瘤胃pH有顯著影響（P＜0.05）。

2.2 不同精粗比日糧對瘤胃液和血漿中LPS含量的影響

飼喂后山羊瘤胃液內(nèi)LPS濃度隨時間變化呈現(xiàn)上升趨勢（P＜0.1）（圖2A），但同一時間點相比2組間無顯著性差異（P＞0.05）。采用雙因子分析日糧類型和發(fā)酵時間兩因素間的主效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)日糧類型對瘤胃液內(nèi)LPS濃度有顯著性影響（P＜0.05），但日糧類型與發(fā)酵時間之間無互作效應(yīng)（P＞0.05）。采食前和采食后6h血漿中LPS濃度也發(fā)生改變，日糧類型對血液LPS濃度產(chǎn)生顯著性影響（P＜0.05）（圖2B），0和6hSARA組血漿內(nèi)LPS濃度均顯著高于對照組（P＜0.05），但日糧類型和發(fā)酵時間之間無交互效應(yīng)（P＞0.05）。

圖1 不同精粗比日糧對瘤胃液pH的影響Fig.1 Effects of different crude ratio diets on pH values in rumen fluid

圖2 不同精粗比日糧對瘤胃液（A）和血漿（B）中LPS含量的影響Fig.2 Effect of different crude ratio diets on LPS content in rumen fluid（A）and plasma（B）

2.3 不同精粗比日糧對瘤胃內(nèi)乳酸的影響

山羊瘤胃液中乳酸含量較低，均小于1 mmol／L（圖3）。采食前SARA組山羊瘤胃液中乳酸濃度顯著高于對照組（P＜0.05），采食后0～4h乳酸含量下降，4h時顯著高于對照組（P＜0.05），6～10h時逐漸增加并極顯著高于對照組（P＜0.01）。然而，對照組乳酸濃度在采食后1h顯著性上升（P＜0.05），采食后2～6h乳酸濃度又急劇下降。采用雙因素方差分析顯示，日糧類型以及日糧類型和發(fā)酵時間交互作用對乳酸濃度具有極顯著效應(yīng)（P＜0.01）。

圖3 不同精粗比日糧對瘤胃內(nèi)乳酸的影響Fig.3 Effect of different crude ratio diets on lactate concentrations in rumen fluid

2.4 不同日糧精粗比對皮質(zhì)醇濃度的影響

與對照組相比，SARA組山羊采食前血液中皮質(zhì)醇濃度有升高的趨勢（P＝0.05，n＝7）（圖4A），采食后6h兩組間差異不顯著（P＞0.05）。采食后0～6h期間，SARA組山羊瘤胃液皮質(zhì)醇濃度呈逐漸上升的趨勢（圖4B），采食后6h達最高水平，10h時基本恢復(fù)至采食前水平，并且在采食后2，4和6h分別顯著高于對照組（P＜0.05，n＝7）。在瘤胃液中皮質(zhì)醇濃度上，日糧類型對其具有極顯著影響（P＝0.006），發(fā)酵時間具有顯著性影響（P＝0.03），日糧類型和發(fā)酵時間之間有互作的趨勢（P＝0.063）。

圖4 不同精粗比日糧對血漿（A）和瘤胃液（B）內(nèi)皮質(zhì)醇濃度的影響Fig.4 Effect of different crude ratio diets on cortisol concentrations in plasma（A）and rumen fluid（B）

2.5 不同精粗比日糧對肝臟GR mRNA表達的影響

與對照組相比，飼喂日糧精粗比6∶4的SARA組山羊肝臟在GR mRNA表達上表現(xiàn)出顯著性下調(diào)（P＜0.05）（圖5）。

圖5 不同精粗比日糧對肝臟GR mRNA表達的影響Fig.5 Effect of different crude ratio diets on GR mRNA expression in liver

3 討論

3.1 不同精粗比對乳酸和pH的影響

SARA是指反芻動物采食過多谷物類易發(fā)酵碳水化合物飼料，導(dǎo)致瘤胃長時間處于低pH值狀態(tài)，并伴隨少量乳酸積累的一種代謝性疾病［17，18］。目前，研究者已將瘤胃pH值作為衡量SARA發(fā)生與否的最有效指標(biāo)。Yang和Beauchemin［19］認為可以把瘤胃pH值低于5.8作為衡量SARA發(fā)生的臨界pH值。本研究顯示，與飼喂精粗比4∶6日糧相比，飼喂精粗比6∶4日糧2周后的山羊瘤胃液pH值在飼喂后1h開始低于5.8，并一直持續(xù)6h后才緩慢上升，試驗后期動物出現(xiàn)厭食、精神萎靡等典型的亞急性酸中毒癥狀，從而表明本試驗已成功誘導(dǎo)泌乳期山羊亞急性瘤胃酸中毒。

目前有關(guān)反芻動物在SARA期間瘤胃內(nèi)是否存在乳酸以及乳酸含量的范圍尚不清楚。Krause和Oetzel［20］研究發(fā)現(xiàn)，奶牛發(fā)生SARA時瘤胃內(nèi)乳酸濃度為0.45～0.74mmol／L；Keunen等［21］報道奶牛瘤胃液中乳酸含量小于10mmol／L；胡紅蓮等［22］認為，當(dāng)日糧中非纖維性碳水化合物／中性洗滌纖維（NFC／NDF）達到2.58時，奶山羊瘤胃中才檢測到乳酸，但其含量低于0.1mmol／L。本研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃內(nèi)存在少量乳酸，其最高濃度低于1 mmol／L，此結(jié)果與以往的報道相一致［19，23］。正常情況下，當(dāng)瘤胃pH下降到6左右時，乳酸生成菌迅速增加，而乳酸利用菌增長速度較慢。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組山羊在采食后1h瘤胃液pH下降到6左右時，乳酸含量激增，此后隨時間延長乳酸逐漸被利用或吸收，出現(xiàn)乳酸濃度下降，之后恢復(fù)到采食前水平。SARA組山羊在飼喂后1 h瘤胃內(nèi)乳酸沒有出現(xiàn)迅速升高，而是呈先降低后上升的過程，并且在采食后期極顯著高于對照組（P＜0.01）。這可能是由于瘤胃長期處于病理狀態(tài)，菌群組成發(fā)生改變，也可能與高精料以及精料組成有關(guān)。據(jù)報道，苜蓿是高果膠（5%～10%）飼料，且富含鈣、鉀等堿性元素，具有較強的緩沖能力，果膠雖在瘤胃中降解快，但發(fā)酵產(chǎn)物是半乳糖醛酸，抑制了酸性乳酸菌的發(fā)酵，從而有助于瘤胃液pH值的穩(wěn)定［24］。在本研究中，SARA組飼料中玉米和麩皮含量高，為乳酸生成菌提供充足的碳源和能源，其中麩皮能增強乳酸菌的耐酸性［24，25］。因此，瘤胃內(nèi)乳酸的積累促進了SARA酸中毒的發(fā)展，與以往的研究結(jié)果相一致［8］。眾所周知，飼料的組成和消化利用率影響反芻動物內(nèi)分泌水平和生產(chǎn)性能［26，27］，SARA對反芻動物內(nèi)分泌、乳成分和乳產(chǎn)量的影響及確切機制仍待進一步研究。

3.2 不同精粗比對脂多糖的影響

脂多糖也是引發(fā)SARA的誘因之一。在正常生理狀態(tài)下，反芻動物瘤胃和血液中含有少量LPS［28］，肝臟和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)完全可以清除這些毒素，所以不會引發(fā)內(nèi)毒素血癥。而有資料報道，谷物誘導(dǎo)反芻動物發(fā)生SARA時往往伴隨著瘤胃和血液中LPS的升高［8，29，30］。SARA時瘤胃內(nèi)酸度逐漸增加，革蘭氏陰性菌大量裂解，釋放內(nèi)毒素——細胞壁主要成分LPS［4，5］，損傷侵染瘤胃壁并少量轉(zhuǎn)移至血液，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥［7］。本試驗研究結(jié)果與以往報道相一致，SARA組山羊血液中LPS含量顯著高于正常組，日糧處理對瘤胃液和血漿內(nèi)LPS均有顯著性影響，并且無論是采食前還是采食后，SARA組瘤胃液和血漿內(nèi)都含有高濃度LPS，提示系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的存在，而LPS的增加可能反過來又加劇了SARA的病情，提示LPS與SARA之間具有相輔相成的效應(yīng)。

3.3 不同精粗比對體內(nèi)皮質(zhì)醇的影響

目前，有關(guān)SARA期間體內(nèi)皮質(zhì)醇濃度變化的研究較少，但注射LPS或IL－6均可引起皮質(zhì)醇的升高。奶牛注射LPS后其外周血中皮質(zhì)醇和腫瘤壞死因子濃度升高［10，11］，LPS可刺激單核細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞引起血液皮質(zhì)醇、促乳素和腫瘤壞死因子濃度的增加［31］，而免疫細胞所釋放的細胞因子導(dǎo)致應(yīng)激軸HPA軸的激活［32］。Niel等［11］的研究證明，給綿羊注射IL－6可引起外周血促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇濃度的升高，并將這2項指標(biāo)作為HPA軸激活的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，SARA組在采食前血漿皮質(zhì)醇濃度均高于對照組，提示SARA組山羊HPA軸被激活，機體可能處于一種慢性應(yīng)激狀態(tài)。本研究還發(fā)現(xiàn)瘤胃液中也存在皮質(zhì)醇，但濃度顯著低于血漿中濃度，關(guān)于瘤胃內(nèi)皮質(zhì)醇的來源，可能是經(jīng)血流通過唾液和瘤胃壁進入瘤胃（內(nèi)源性）［33］。有學(xué)者指出，反芻動物下丘腦－垂體－靶細胞分泌的激素可以作用于機體特殊的靶細胞——瘤胃微生物而影響瘤胃代謝，瘤胃內(nèi)容物存在內(nèi)分泌激素和遞質(zhì)，如甾體類激素17β－雌二醇，可參與調(diào)節(jié)瘤胃內(nèi)微生物的發(fā)酵［34，35］。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)SARA組山羊瘤胃液中皮質(zhì)醇水平在采食后2～6h顯著高于對照組（P＜0.05），并且日糧類型對瘤胃液中皮質(zhì)醇濃度具有極顯著影響（P＝0.006）。而有關(guān)高濃度皮質(zhì)醇是否會對瘤胃發(fā)酵和瘤胃壁營養(yǎng)物質(zhì)的吸收產(chǎn)生影響，或者是否與內(nèi)毒素LPS一起促進瘤胃壁的損傷造成內(nèi)毒素血癥，仍有待于進一步研究。

糖皮質(zhì)激素作為主要的應(yīng)激激素，參與調(diào)節(jié)機體免疫功能、炎癥反應(yīng)和物質(zhì)代謝等功能，慢性應(yīng)激常導(dǎo)致機體物質(zhì)代謝的紊亂［36，37］。肝臟作為體內(nèi)重要的物質(zhì)代謝器官，在糖、脂肪、蛋白質(zhì)和維生素等物質(zhì)代謝中起重要作用，肝臟上存在高豐度的糖皮質(zhì)激素受體GR，接受糖皮質(zhì)激素的信息并作出適應(yīng)性調(diào)節(jié)［13］。本試驗中，SARA組山羊血液皮質(zhì)醇濃度顯著升高，伴隨肝臟GR基因表達顯著下調(diào)，此現(xiàn)象是機體應(yīng)對糖皮質(zhì)激素升高的負反饋調(diào)節(jié)結(jié)果。肝臟糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)是否引起下游信號通路的改變，以及對肝臟物質(zhì)代謝及營養(yǎng)重分配是否產(chǎn)生影響仍需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究在成功誘導(dǎo)泌乳期山羊瘤胃SARA的基礎(chǔ)上，分析了瘤胃液中pH、LPS和乳酸的變化，并首次報道SARA時血漿和瘤胃液中糖皮質(zhì)激素水平升高以及肝臟GR受體的反饋性下調(diào)，提示患SARA時HPA軸的激活可能引起肝臟的物質(zhì)代謝和營養(yǎng)物質(zhì)重分配的改變。

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