申成利，陳明霞，李國棟，張建國

（華南農業(yè)大學農學院草業(yè)科學系，廣東 廣州510642）

柱花草屬（Stylosanthes）牧草是世界上熱帶亞熱帶地區(qū)最重要的豆科牧草，廣泛用于青飼料、草粉生產、放牧、水土保持、果園覆蓋和綠肥作物等［1］。柱花草屬牧草約有50個種，在世界熱帶豆科牧草生產中占有重要地位。它的大部分品種原產南美洲、中美洲和加勒比海地區(qū)，喜熱帶潮濕氣候，適合北緯23℃以南、年均溫19～25℃、年降水量1 000mm左右的地區(qū)種植［2］。我國于1962年首次從馬來西亞引種柱花草到海南島，目前，柱花草在海南、廣東、廣西、福建、云南、四川、貴州、重慶等省（區(qū)）推廣種植面積已超過20多萬hm2，已成為我國南方熱帶草業(yè)的當家草種，形成了“北有苜蓿草，南有柱花草”的草業(yè)發(fā)展新格局，促進了我國熱帶草業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展［3］。

柱花草是豆科柱花草屬多年生草本植物，其莖葉繁茂，根系發(fā)達，生物產量大，營養(yǎng)豐富，每kg干物質含粗蛋白156～243g，是稻谷、玉米的2～3倍；每公頃產總能109.75GJ，比玉米、稻谷高65%～69%，是重要的蛋白質和能量飼料來源［4，5］。在飼用柱花草的過程中，發(fā)現柱花草對動物的生長發(fā)育和繁殖等有明顯的促進作用，很多種畜禽場已把柱花草粉作為添加劑來使用，市場潛力巨大。但由于華南地區(qū)陰雨天多，給柱花草干草（粉）的加工帶來了不少的難度，造成有市無貨局面。因此，應重視與當地氣候特點相適應的加工貯藏方法，以解決“季節(jié)不平衡”和“地區(qū)不平衡”矛盾，提高種草的經濟效益［6］。柱花草因生長前期葉上的茸毛及葉尖對家畜口腔有刺激性，青飼適口性較差，對其進行曬干處理，適口性雖有所提高，但營養(yǎng)物質損失增大，而且其大部分營養(yǎng)生長期處于華南地區(qū)的雨季，將其加工成干草較難。有報道指出，加工草顆粒與草粉是柱花草的有效利用途徑［7］，但成本過高，不利推廣；也有報道指出，青貯是華南地區(qū)柱花草利用的新途徑［8］，但因柱花草的可溶性糖含量低，緩沖能高，較難青貯。菠蘿皮是菠蘿罐頭生產的下腳料（約占原果的60%），長期以來，被認為是農產品廢棄物而丟棄或填埋，導致環(huán)境污染。菠蘿皮的可溶性糖含量較高，但國內對菠蘿皮的深加工及利用較少［9］，陳明霞和張建國［10］的研究結果表明添加菠蘿皮對飼料稻發(fā)酵品質的改善有較好的效果。因此，本試驗研究了添加乳酸菌和菠蘿皮（B）對柱花草青貯發(fā)酵品質和有氧穩(wěn)定性的影響，為柱花草的青貯加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2010年10月18日收割處于初花期的柱花草，距地面8～10cm全株收割。收割后帶回實驗室，切短至1～2 cm，混合均勻，留0.5kg用于鮮樣分析，剩余材料分別進行青貯處理。菠蘿皮是從水果市場收集的新丟棄物，切成小塊備用。

乳酸菌添加劑為青貯寶（LQ，寶來利來生物工程有限責任公司），乳酸菌LF（發(fā)酵乳桿菌）、乳酸菌LP（植物乳桿菌）和乳酸菌LS（鼠李糖乳桿菌）。LF、LP和LS為華南農業(yè)大學農學院草產品加工實驗室分離菌株。

1.2 青貯處理

本試驗設菠蘿皮和乳酸菌兩因素。菠蘿皮分為無添加和添加，乳酸菌為無添加、LQ、LF、LP、LS，共10個處理，即：CK、LQ、LF、LP、LS，B（20%菠蘿皮），BLQ（B＋LQ）、BLF（B＋LF）、BLP（B＋LP）、BLS（B＋LS）。每個處理3個重復。

1.3 測定方法

1.3.1 青貯飼料的調制 各種乳酸菌的添加量為105cfu／g FM（鮮重），菠蘿皮的添加量為20%，每個處理3袋，每袋約200g。處理后的材料裝入30cm×20cm的聚乙烯青貯袋，用真空密封機（SINBO Vacuum Sealer，Hong Tai Home Electrical Appliance Co.Ltd.）抽氣、密封，置于室溫貯藏60d。

1.3.2 材料營養(yǎng)成分及微生物分析 干物質（DM）含量采用70℃干燥法測定，粗蛋白含量采用凱氏定氮法測定（定氮儀KDN－103F，上海纖檢儀器有限公司），粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量在范氏法（Van Soest）的基礎上使用改進的濾袋分析法（ANKOM A200i，北京）測定［11］，粗脂肪含量采用殘余法測定（SLF－06，杭州托普儀器有限公司），粗灰分含量采用灼燒法測定［12］?？扇苄蕴妓衔铮╳ater soluble－carbohydrates，WSC）含量采用蒽酮－硫酸法測定［13］，氨態(tài)氮（NH3－N）含量用凱氏定氮儀直接蒸餾測定，緩沖能采用鹽酸、氫氧化鈉滴定法測定［14］，乳酸菌、細菌和酵母菌數量分別采用 MRS（de－Man Rogosa Sharpe）瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient ager，廣東環(huán)凱微生物有限公司）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato－dextrose agar，廣東環(huán)凱微生物有限公司）計數［15］。乳酸菌用厭氧箱（YQXⅡ型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），37℃培養(yǎng)2～3d；細菌和酵母菌用生化培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)2～4d。

1.3.3 發(fā)酵品質分析 青貯袋開封后，取20g混勻的青貯料放入聚乙烯塑料封口袋中，加入80mL蒸餾水，在4℃下浸泡18h后過濾，用pH計（PHS－3B，上海鵬順科學儀器有限公司）測定浸提液pH值［16］。有機酸含量采用島津LC－20AT型高效液相色譜儀測定［17］，色譜條件：色譜柱（KC－811），流動相為3mmol／L的 HClO4液，流速1mL／min，柱溫60℃，檢測波長210nm。

1.3.4 有氧穩(wěn)定性分析 青貯袋開封后，無菌操作混勻材料，然后取出一部分進行發(fā)酵品質分析，剩下的材料不封口放置于室內，分別有氧放置2，4，6d后，取袋中已混勻樣品20g，測定pH值。pH值上升幅度越小，有氧穩(wěn)定性則越好，反之則較差。

1.4 統(tǒng)計方法

采用Excel和SPSS 10軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析。其中，乳酸菌與含糖物質的添加使用雙因素方差分析。有氧穩(wěn)定性測定的數據采用Excel處理。

2 結果與分析

2.1 青貯前柱花草與菠蘿皮特性

柱花草的乳酸菌少于105cfu／g FM，好氣性細菌和酵母菌數較多，緩沖能（340mE／kg DM）較高，WSC含量（3.91%DM）較低，這些都不利于青貯飼料的發(fā)酵。干物質含量為34.10%，水分含量適中（表1）。作為本試驗添加物之一的菠蘿皮，其WSC含量較高（42.83%DM）（表1），可以彌補柱花草青貯材料WSC較低的缺陷，可為乳酸菌提供充足的發(fā)酵底物。

2.2 添加物對青貯發(fā)酵品質的影響

單 獨添加乳酸菌或菠蘿皮對柱花草青貯料的pH、乳酸含量、NH3－N含量和乳酸乙酸比都有顯著影響（P＜0.05），乳酸菌和菠蘿皮的互作對乙酸之外的指標都達到了極顯著（P＜0.01）。乳酸菌或菠蘿皮單獨添加對丙酸含量影響不顯著，而它們互作顯著（P＜0.05）。乳酸菌添加顯著降低丁酸含量 （P＜0.05），除LP外，單獨添加菌對乙酸含量影響不顯著（P＞0.05），菠蘿皮則正好相反（表2）。與對照相比，單獨添加菌雖然顯著降低了丁酸含量，但未能完全抑制丁酸發(fā)酵，而乳酸菌與菠蘿皮混合添加很少或無丁酸產生。所有處理中，對照的pH值（5.26）和NH3－N含量（18.21%）最高，乳酸含量最低（1.26%），所有添加處理都顯著降低了pH值和NH3－N含量，提高了乳酸含量，特別是乳酸菌和菠蘿皮的混合添加。除BLS外，混合添加的pH都顯著低于乳酸菌或菠蘿皮單獨添加（P＜0.05），而且低于4.2，達到了良好的青貯效果。

各種乳酸菌和菠蘿皮單獨添加的青貯料，它們的乳酸含量、丙酸含量和乳酸乙酸比沒有顯著差異（P＞0.05），但添加乳酸菌的丁酸含量和NH3－N含量顯著低于B處理組。除LP外，單獨添加乳酸菌的pH與B添加沒有顯著差異。LP的乙酸含量顯著高于LF、丁酸含量顯著低于LQ和LF（P＜0.05）。結果表明，添加乳酸菌和菠蘿皮都可明顯改善柱花草青貯料的發(fā)酵品質，但乳酸菌，特別是LP的效果優(yōu)于菠蘿皮，而兩者結合效果更佳。

表1 青貯前柱花草和菠蘿皮的特性Table 1 Characteristics of Stylosanthes and pineapple residue before ensiling

表2 添加物對柱花草青貯發(fā)酵品質的影響Table 2 Effects of additives on the fermentation quality of Stylosanthes silage

2.3 添加物對青貯有氧穩(wěn)定性的影響

柱花草青貯料開封暴露于空氣中6d后，所有處理的pH值都沒有顯著變化（P＞0.05），乳酸含量除了LF和LS外也無顯著變化（圖1），LF和LS處理的乳酸含量雖顯著降低，但都還有70%以上被保留下來（分別為71%和79%），說明所有的柱花草青貯料的有氧穩(wěn)定性都比較好。

圖1 柱花草青貯料開封6d后的pH值和乳酸含量變化Fig.1 The changes of the pH and lactic acid contents of Stylosanthes silages after exposed to the air for 6days

3 討論

3.1 材料特性

乳酸菌的數量和WSC含量是影響青貯飼料發(fā)酵品質的2個重要因素，其中之一不足都會限制乳酸發(fā)酵［18］。一般情況下，青貯原料乳酸菌超過105cfu／g FM［17］，WSC含量超過25～35g／kg［19］，才能獲得優(yōu)質青貯料。本試驗所用材料的乳酸菌數量少于105cfu／g FM，好氣性細菌和酵母菌數較多，緩沖能較高，WSC含量較低，這些都不利于優(yōu)質青貯飼料的調制。近年來，糖類也常用作青貯材料的添加劑來提高青貯發(fā)酵品質［20］，但成本比較高，經濟效益差。菠蘿皮的WSC含量較高（42.83%DM），將菠蘿皮作為添加劑不僅可以解決柱花草WSC含量低、難以青貯的問題，同時可使菠蘿皮得到有效利用，提高經濟效益。

3.2 添加物對青貯發(fā)酵品質的影響

一般情況下，青貯成功的關鍵在于促進乳酸菌的大量繁殖，然而，材料上附著的乳酸菌數遠低于好氣性微生物（好氣細菌和真菌等）。在厭氧條件下，當材料水分、緩沖能、可溶性碳水化合物含量適宜時，附著的乳酸菌大量繁殖，材料pH值迅速降低，有害菌（大腸桿菌、梭菌、芽孢桿菌、酵母菌、霉菌等）則受到抑制，因此，pH值是判別青貯品質好壞的主要指標之一［19］。

近年來，各國研究實踐證明接種產酸能力強的乳酸菌是提高牧草發(fā)酵品質的有效方法［21，22］，然而這些研究多針對溫帶牧草或作物而言。Uchida和Kitamura［23］指出接種乳酸菌到WSC含量低的熱帶牧草中對改善發(fā)酵品質的效果不明顯。但本試驗的結果表明，添加乳酸菌可以顯著降低柱花草青貯飼料的pH值、丁酸和NH3－N含量，同時乳酸含量和乳乙酸比顯著提高，說明添加乳酸菌可以改善其發(fā)酵品質。原因可能是材料本身的乳酸菌數量較少，沒有達到105cfu／g FM，添加后促進了乳酸發(fā)酵。本試驗的結果表明，單獨添加菠蘿皮也能顯著降低柱花草青貯料的pH值并提高乳酸含量，但其丁酸和NH3－N含量卻顯著高于單獨添加乳酸菌，原因可能是菠蘿皮內含有降解蛋白質的酶［24］，分解了更多的蛋白質，產生的NH3－N較多。B處理的NH3－N含量之所以顯著低于CK，可能是因為B的pH低、有機酸含量多，對蛋白質分解的梭狀芽孢桿菌有一定抑制作用。

單獨添加乳酸菌的乳酸乙酸比顯著高于CK，可能是因為添加乳酸菌之后促進了柱花草青貯料的乳酸發(fā)酵，乳酸含量顯著增加，而乙酸含量除了LP以外都沒有顯著變化。單獨添加菠蘿皮之后WSC含量增加，為乳酸菌提供了更多的發(fā)酵底物，促進了乳酸發(fā)酵，雖然同時也產生了較多的乙酸，但乳酸乙酸比較CK高，說明菠蘿皮的添加也促進了同型發(fā)酵。BLQ和BLP顯著高于其他所有處理，因為LQ和LP是同型發(fā)酵菌，而且又添加了足夠的WSC，產生的乳酸含量顯著增加，而乙酸含量無顯著變化。BLF的乳酸乙酸比與單獨添加菌無顯著差異，顯著低于BLQ和BLP，可能是因為LF是異型發(fā)酵乳酸菌。鼠李糖乳桿菌是優(yōu)良的生產L－乳酸的細菌，但它在高糖濃度下會受到抑制并且它對營養(yǎng)要求苛刻［25，26］，對增加乳酸產量效果不好，所以，在混合添加處理組中，BLS的乳酸含量最低，使得乳酸乙酸比顯著低于BLQ和BLP。

3.3 添加物對有氧穩(wěn)定性的影響

青貯容器開封后，厭氧環(huán)境立即變成有氧環(huán)境，好氣微生物開始活動。通常，青貯飼料的好氣變質主要是由酵母、霉菌等的活動所引起［27，28］。當青貯飼料暴露于空氣中時，青貯發(fā)酵產生的乳酸及牧草中的氨基酸、蛋白質和糖類等會被酵母和霉菌利用，使青貯飼料CO2、水和氨逐漸增加，使pH逐漸上升，好氣變質不斷加?。?9，30］。本試驗所有青貯料在開封6d后的pH都沒有顯著變化，可能是因為本試驗中所有的青貯料丙酸含量較高，而丙酸抑制酵母的效果較強［31］。這也被開封時所有的青貯料都未能檢測到酵母菌（低于檢查水平5×102cfu／g FM）所證實。

4 結論

本研究所用4種乳酸菌與菠蘿皮單獨添加都能明顯改善柱花草的青貯發(fā)酵品質，二者混合添加效果更佳，特別是菠蘿皮與乳酸菌LP混合。4種乳酸菌中乳酸菌LP在部分發(fā)酵指標上優(yōu)于其他3種，而且它們都優(yōu)于單獨添加菠蘿皮。無論是添加菠蘿皮或乳酸菌，還是混合添加，它們的有氧穩(wěn)定性與對照一樣非常穩(wěn)定。

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