徐春波，王勇，趙海霞，米福貴＊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010）

＊紫花苜蓿（Medicagosativa）簡稱苜蓿，是全世界栽培歷史最悠久、面積最大、利用最廣泛的一種豆科多年生優(yōu)質(zhì)牧草。它具有蛋白質(zhì)含量高、草質(zhì)好、營養(yǎng)豐富等特點，還具有固氮、保持水土等作用，故又將其稱之為“牧草之王”［1－3］。近年來，隨著我國草地畜牧業(yè)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，草產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出強勁的發(fā)展勢頭。苜蓿作為草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主導(dǎo)草種，它在北方高緯度、冬季嚴寒、倒春寒常出現(xiàn)等地區(qū)的安全越冬問題，一直是制約上述地區(qū)草產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的突出問題。因此，如何在短時間內(nèi)培育出適合我國北方高緯度等地區(qū)種植的抗寒高產(chǎn)苜蓿新品種，便成為一個急待解決的問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展和在苜蓿育種中的應(yīng)用［4－6］，為快速選育抗寒高產(chǎn)苜蓿品種提供了新的研究手段。

CBF1轉(zhuǎn)錄激活因子是一類受低溫特異誘導(dǎo)的反式作用因子［7－9］。它能與CRT／DREDNA［C－repeat／dehydration－responsive element（DRE）DNA binding protein］調(diào)控元件特異結(jié)合，促進啟動子中含有這一調(diào)控元件的多個冷誘導(dǎo)和脫水誘導(dǎo)基因的表達，從而激活植物體內(nèi)的多種耐逆機制［10］。目前已經(jīng)在油菜（Brassicanapus）、番茄（Lycopersiconesculentum）、煙草（Nicotianatabacum）、多年生黑麥草（Loliumperenne）和黃瓜（Cucumissativus）等［11－20］植物中得到了應(yīng)用。金建鳳等［21］、吳關(guān)庭等［22］和林秀鋒等［23］均利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將抗凍轉(zhuǎn)錄激活因子基因CBF1轉(zhuǎn)入水稻（Oryzasativa），并獲得了T1代轉(zhuǎn)基因植株。金建鳳等［21］的研究結(jié)果表明，T1代植株體內(nèi)的脯氨酸含量均比野生型明顯提高，同時，耐低溫表型也在T1－1株系中出現(xiàn)。吳關(guān)庭等［22］和林秀鋒等［23］對T1代進行低溫試驗表明，轉(zhuǎn)基因株系的葉片相對電導(dǎo)率顯著或極顯著低于對照，轉(zhuǎn)基因植株比對照的抗寒能力提高。袁維風(fēng)等［24］和金萬梅等［25］利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CBF1基因?qū)氩葺‵ragariaananassa）的不同品種中，采用電解質(zhì)滲漏法對轉(zhuǎn)基因株系進行抗寒生理鑒定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系的電導(dǎo)率普遍低于對照。金萬梅等［25］采用生長恢復(fù)法抗寒鑒定結(jié)果表明，將轉(zhuǎn)基因株系和對照于－2～0℃放置7d，在轉(zhuǎn)基因株系83中有65%的植株出現(xiàn)了萎蔫，而對照植株有91%出現(xiàn)了萎蔫，經(jīng)22～25℃下進行恢復(fù)生長，轉(zhuǎn)基因株系83有74%完全恢復(fù)，而對照株系只有18%恢復(fù)，轉(zhuǎn)基因草莓的抗寒能力較未轉(zhuǎn)化植株有明顯提高，且不同轉(zhuǎn)基因株系之間提高程度有差異。王渭霞等［26］將來源于擬南芥（Arabidopsisthaliana）的CBF1基因通過農(nóng)桿菌法導(dǎo)入松南結(jié)縷草（Zoysiasp.）植株中，PCR驗證后187株表現(xiàn)為陽性。陽性植株移栽成活后，離體葉片抗巴龍霉素檢測表明187株均表現(xiàn)出抗性。

本實驗以擬南芥基因組DNA為模板，利用PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)，polymerase chain reaction）法克隆得到了冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AtCBF1基因，在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了含有此基因的植物表達載體pBI121－CBF1，并采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對紫花苜蓿進行了遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR和RT－PCR（反轉(zhuǎn)錄RCR，reverse transcription PCR）檢測，得到了650bp左右的電泳條帶，表明AtCBF1基因已在紫花苜蓿中得到表達。這為選育紫花苜?？购缕贩N奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型，由北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心提供；紫花苜蓿品種為“Hunter－river”，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α、農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株 C58、質(zhì)粒pBI121由北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心園林實驗室保存；載體pGEM－Tvector（簡稱T載體）購自上海生物工程有限公司。

1.1.3 供試試劑 實驗中所用的各種限制性內(nèi)切酶、RNaseA、Taq酶、dNTP、T4連接酶等購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒、T載體連接試劑盒等購自Promega公司；Marker購自TaKaRa公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI GenBank已報道CBF1基因的DNA序列，應(yīng)用DNAMAN軟件設(shè)計引物（CBF1－BamHI－5′端：5′－TCTGGGATCCATGAACTCATTTTCAG－3′；CBF1－Sac1－3′端：5′－TCTGGAGCTCTTAGTAACTCCAAAGCG－3′），由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2.2AtCBF1基因的克隆 以擬南芥基因組DNA為模板，用設(shè)計好的引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃30s、55℃30s、72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10min；18℃反應(yīng)結(jié)束。PCR產(chǎn)物連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，在含有IPTG（異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷，isopropylβ－D－1－thiogalactopyranoside）和 X－gal（5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D 半乳糖苷，5－bromo－4－chloro－3－indolylβ－D－galactopyranoside）的LB＋Amp（細菌培養(yǎng)，Luria－Bertani＋氨芐青霉素，ampicillin）固體平板上篩選白色菌落，對重組子TCBF1進行PCR和酶切檢測鑒定后，送交北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進行測序驗證。

1.2.3 植物表達載體pBI121－CBF1的構(gòu)建 將質(zhì)粒pBI121和質(zhì)粒T－CBF1同時用BamHI和SacI雙酶切后，回收載體片段和AtCBF1基因片段，將2個片段用T4DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有Kan抗性的LB培養(yǎng)基平板上篩選陽性菌落，挑單菌落進行菌液PCR，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定，構(gòu)建成植物表達載體pBI121－CBF1。

1.2.4 植物表達載體pBI121－CBF1的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 通過電擊法將植物表達載體pBI121－CBF1轉(zhuǎn)化入感受態(tài)農(nóng)桿菌C58中，在直徑9cm的篩選培養(yǎng)基［LB＋25mg／L Rif（氯福平，rifampicin）＋100mg／L Kan（卡那霉素，kanamycin）＋5mg／L Tet（四環(huán)素，tetracycline）］獲得轉(zhuǎn)化菌落，用PCR法對轉(zhuǎn)化菌落進行鑒定。

1.2.5 紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化及抗性篩選 將紫花苜蓿種子用70%的酒精和20%的次氯酸鈉分別處理1和15min后接種到無菌苗培養(yǎng)基1／2MS上培養(yǎng)。切取7d齡無菌苗下胚軸，在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基［改良SH＋4.0mg／L 2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸鈉，2，4－dichlorophenoxyacetic acid）＋0.5mg／L 6－BA（6－芐基嘌呤，6－benzylaminopurine）］預(yù)培養(yǎng)3d，在活化的農(nóng)桿菌（含CBF1基因）菌液中侵染10min，置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d，經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)［改良SH＋4.0mg／L 2，4－D＋0.5mg／L 6－BA＋350mg／L Cef（頭孢霉素，cefotaxime）＋60 mg／L Kan］、繼代篩選培養(yǎng)［MSO＋0.5mg／L NAA（萘乙酸，naphthalene－acetic acid）＋1.0mg／L 6－BA＋1.0 mg／L AgNO3＋350mg／L Cef＋60mg／L Kan］、分化篩選培養(yǎng)（MS＋350mg／L Cef＋20mg／L Kan）和生根篩選培養(yǎng)（1／2MS＋350mg／L Cef＋20mg／L Kan）后得到紫花苜蓿抗性轉(zhuǎn)化植株。

1.2.6 轉(zhuǎn)化植株的PCR和RT－PCR鑒定 轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測：用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨法，hexade－cyltrimethy ammonium bromide）法提取轉(zhuǎn)化植株DNA，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化植株作為陰性對照進行PCR檢測。反應(yīng)體系25μL，反應(yīng)條件同AtCBF1基因克隆時的條件。

轉(zhuǎn)化植株RT－PCR檢測：按照RNA提取試劑盒的操作方法提取轉(zhuǎn)化植株總RNA，根據(jù)RT－PCR試劑盒所提供的操作方法進行反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtCBF1基因克隆的鑒定及序列分析

以擬南芥DNA為模板進行PCR擴增，得到650bp左右的DNA片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。將其連接到T載體上得到重組質(zhì)粒T－CBF1，對其進一步進行酶切鑒定后，得到3 000和650bp左右的2條DNA片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致。將其送交北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進行測序驗證。測序結(jié)果表明所克隆的DNA片段長度為642bp，將該序列與GenBank上的CBF1基因序列進行DANMAN序列比較分析，同源性可達99.84%（圖3），核苷酸比較結(jié)果表明本實驗通過PCR克隆的AtCBF1片段確為擬南芥的CBF1基因，具有正常的生理功能，可用于下一步遺傳轉(zhuǎn)化研究。

圖1 AtCBF1基因片段的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of AtCBF1gene fragment

圖2 T－CBF1酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion of T－CBF1

圖3 AtCBF1基因序列比對圖（同源性99.84%）Fig.3 Sequence alignment of CBF1（identity＝99.84%）

2.2 植物表達載體pBI121－CBF1的鑒定

構(gòu)建的pBI121－CBF1植物表達載體圖譜（圖4），增加了1個BamHI位點和1個SacI酶切位點，根據(jù)載體上這2種酶的酶切位點的特點，用BamHI和SacI進行雙酶切鑒定，得到2個片段，一個為AtCBF1基因，大約為650 bp，另一個為載體，約為12.9kb。從電泳檢測的結(jié)果來看（圖5），所構(gòu)建的pBI121－CBF1表達載體正確。

圖4 植物表達載體pBI121－CBF1質(zhì)粒圖譜Fig.4 Plasmid map of plant transformation vector pBI121－CBF1

2.3 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

采用電擊法將構(gòu)建好的載體pBI121－CBF1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株C58，隨機挑取6個轉(zhuǎn)化菌落進行PCR鑒定，結(jié)果顯示6個轉(zhuǎn)化菌落均擴增出650bp左右的特異性條帶，說明表達載體pBI121－CBF1成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58中（圖6）。

圖5 pBI121－CBF1酶切鑒定Fig.5 Restriction enzyme digestion of pBI121－CBF1

圖6 pBI121－CBF1導(dǎo)入農(nóng)桿菌的PCR檢測Fig.6 PCR analysis of pBI121－CBF1transferred Agrobacterium

2.4 紫花苜?？剐赞D(zhuǎn)化植株的獲得

將紫花苜蓿的下胚軸經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)3d后，用農(nóng)桿菌侵染10min，置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中，在經(jīng)過繼代篩選培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基中，待分化出3～5cm的小苗時轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基，最終獲得抗Kan的紫花苜蓿轉(zhuǎn)化植株（圖7）。

2.5 轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定

提取轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA，以質(zhì)粒pBI121－CBF1做陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因植株作為陰性對照，進行PCR擴增。結(jié)果表明，部分轉(zhuǎn)化植株擴增出了與陽性對照相同的大小為650bp左右的特異帶，而陰性對照的泳道上沒有該特征帶，表明目的基因CBF1已經(jīng)整合到“Hunter－river”紫花苜?；蚪M中（圖8）。

2.6 轉(zhuǎn)化植株的RT－PCR鑒定

為了檢測CBF1基因在苜蓿轉(zhuǎn)化植株中mRNA水平上的表達情況，提取轉(zhuǎn)化植株總RNA（圖9），進行了RT－PCR檢測。結(jié)果顯示（圖10），在PCR結(jié)果呈陽性的轉(zhuǎn)化植株中，RT－PCR結(jié)果并不全呈陽性，說明PCR有假陽性的存在，同時也表明外源基因CBF1在部分苜蓿轉(zhuǎn)化植株的轉(zhuǎn)錄水平上表達。

3 討論

3.1 AtCBF1基因的克隆

植物的耐逆性屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀，是多種耐逆機制共同作用的結(jié)果。用單一的功能基因轉(zhuǎn)化植物，雖能使轉(zhuǎn)基因后代的耐冷性、耐旱性或耐鹽性得到提高，但效果并不十分理想。CBF轉(zhuǎn)錄激活因子的發(fā)現(xiàn)則為基因工程改良植物耐逆性提供了一種全新的技術(shù)途徑［27］。本實驗以擬南芥DNA為模板，用篩選出的CBF1特異引物進行PCR擴增，得到了約650bp DNA片段，通過PCR和酶切鑒定后進行DNA測序，結(jié)果表明DNA片段實際大小為642bp，與GenBank中基因序列進行比對，同源性達99.84%，只是在460bp的堿基A置換成T，2個堿基的置換導(dǎo)致了一處氨基酸的差異，但這一氨基酸并不在基因的功能結(jié)構(gòu)域上，推測其不會影響基因功能，可用于下一步的實驗。

圖7 轉(zhuǎn)化再生植株流程圖Fig.7 Obtaining of the transformed plants

圖8 轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定Fig.8 PCR identification of transformed plants

圖9 轉(zhuǎn)化植株總RNAFig.9 Total RNA of transformed plants

3.2 表達載體的構(gòu)建

構(gòu)建含有目的基因的高效植物表達載體，是進行植物遺傳轉(zhuǎn)化的一個重要前提。本實驗構(gòu)建成功了由組成型啟動子CaMV35s調(diào)控冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AtCBF1基因的植物表達載體pBI121－CBF1，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58中，為進一步進行紫花苜蓿農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。在載體的構(gòu)建中，現(xiàn)普遍用的是35S啟動子，它能使外源基因在植物的各個部位都表達，特異性較差，且大多數(shù)基因都存在功能定位，外源基因在植物體內(nèi)表達會產(chǎn)生許多沒有功能的蛋白質(zhì)，可能會影響植物的正常生理代謝，下一步擬構(gòu)建用AtCBF1特異性啟動子替換CaMV35s啟動子的植物表達載體，便于更好地發(fā)揮AtCBF1基因的功能，更加有利于紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化。

圖10 轉(zhuǎn)化植株的RT－PCR鑒定Fig.10 RT－PCR identification of transformed plants

3.3 農(nóng)桿菌菌株對轉(zhuǎn)化效率的影響

農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，含有致瘤Ti質(zhì)粒，宿主范圍廣泛，在自然狀態(tài)下能通過傷口侵染植物。菌株的侵染能力是轉(zhuǎn)化中關(guān)鍵的因素之一。菌株對材料的轉(zhuǎn)化能力體現(xiàn)在2個方面：一是農(nóng)桿菌能否吸附在植物細胞表面，Vir區(qū)能否誘導(dǎo)表達，T－DNA能否轉(zhuǎn)至植物細胞并整合到植物基因組中；二是菌株對植物材料細胞的傷害程度。菌株的侵染能力是轉(zhuǎn)化中最關(guān)鍵的因素之一。農(nóng)桿菌有效地附著于植物細胞上是保證其TDNA進入寄主植物細胞的前提，因此選擇合適的菌株是轉(zhuǎn)化成功的必要前提。本實驗使用的農(nóng)桿菌菌株C58，載體pBI121－CBF1含有CaMV35S啟動子、GUS基因、AtCBF1基因和Kan基因，這為基因的成功轉(zhuǎn)化提供了很好的條件。

3.4 Kan對轉(zhuǎn)化率的影響

在選擇壓力下，不含標記基因及其產(chǎn)物的非轉(zhuǎn)化細胞和組織死亡，而轉(zhuǎn)化細胞由于有抗性，可以繼續(xù)存活，因而有利于從大量的非轉(zhuǎn)化細胞和組織中選擇出轉(zhuǎn)化克隆［28，29］。不同植物的外植體對Kan具有不同的敏感性，因此在轉(zhuǎn)化之前確定合適濃度的Kan，以便在這個合適濃度的選擇壓力下，非轉(zhuǎn)化細胞的生長能有效地被抑制，緩慢死亡，轉(zhuǎn)化細胞正常生長，發(fā)育［30］。本實驗中，苜蓿的外植體在愈傷階段對Kan不太敏感，需要60mg／L來進行篩選。但過高的選擇壓可能會降低轉(zhuǎn)化體細胞的分裂活性，致使再生芽出現(xiàn)很少，因此本實驗采用了在其分化和生根階段將Kan濃度降低至20mg／L，有利于轉(zhuǎn)化率的提高。

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