韓斐斐，亓海剛，李莉，張國(guó)范，閆喜武，李慧娟，楊霏，王琳楠

（1. 大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023；2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，山東 青島 266071）

長(zhǎng)牡蠣基因組微衛(wèi)星引物的開發(fā)和特性描述

韓斐斐1,2，亓海剛2，李莉2，張國(guó)范2，閆喜武1，李慧娟1,2，楊霏1，王琳楠1

（1. 大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023；2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，山東 青島 266071）

長(zhǎng)牡蠣于20世紀(jì)80年代從日本引進(jìn)中國(guó)。在我國(guó)，長(zhǎng)牡蠣已經(jīng)成為重要的貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)之一。本實(shí)驗(yàn)從全基因組上篩查微衛(wèi)星序列，在微衛(wèi)星篩查的范圍、數(shù)目和類型上是傳統(tǒng)的富集文庫(kù)法開發(fā)微衛(wèi)星所無法比擬的。利用基因組微衛(wèi)星序列總共設(shè)計(jì)了104對(duì)引物，54對(duì)引物能擴(kuò)增出目的片段，其中有34對(duì)引物顯示多態(tài)性擴(kuò)增，占32.7%，20對(duì)引物顯示單態(tài)性擴(kuò)增，占19.2%。在自然群體48個(gè)個(gè)體樣本中分析了這些位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果表明：等位基因數(shù)目在2～8之間，觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別在0.065 2～0.795 5和0.063 8 ～0.853 4之間。34對(duì)微衛(wèi)星分子標(biāo)記中有7對(duì)符合哈迪－溫伯格平衡，27對(duì)或多或少的偏離平衡。微衛(wèi)星分子標(biāo)記可以用作分子遺傳育種、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析、親緣關(guān)系分析等方面。

長(zhǎng)牡蠣；微衛(wèi)星；標(biāo)記開發(fā)；基因組

長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）又稱太平洋牡蠣，屬于軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱，翼形亞綱，珍珠貝目，牡蠣科，具有個(gè)體大、生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、成活率高等特點(diǎn)[1]。20世紀(jì)80年代初從日本引入我國(guó)，80年代末在我國(guó)北部沿海大面積養(yǎng)殖，是我國(guó)海產(chǎn)貝類養(yǎng)殖中規(guī)模大、產(chǎn)量高的養(yǎng)殖品種之一[2]，也是世界上產(chǎn)量最高的養(yǎng)殖貝類品種之一[3]。我國(guó)牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量在近 10年一直呈上升趨勢(shì)，長(zhǎng)牡蠣的產(chǎn)量約占牡蠣總產(chǎn)量的1/3[4]。

微衛(wèi)星（microsatellite）DNA，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STRs）或簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSRs），是指由1～6 個(gè)核苷酸組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)DNA 序列，它是一種DNA長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記，并且具有多態(tài)性強(qiáng)，呈共顯性遺傳等特點(diǎn)。微衛(wèi)星作為一種分子標(biāo)記，已成為種群研究和進(jìn)化生物學(xué)最常用的分子標(biāo)記之一，廣泛地應(yīng)用于生物雜交育種、遺傳連鎖圖譜、種群遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)生等研究領(lǐng)域[5]。微衛(wèi)星的特點(diǎn)主要體現(xiàn)在共顯性標(biāo)記、多態(tài)信息含量高、結(jié)果穩(wěn)定可靠。

李琪[6]等采用磁珠雜交選擇和PCR篩選法，從長(zhǎng)牡蠣DNA選擇片段文庫(kù)中，分離含有微衛(wèi)星序列的陽(yáng)性克隆56個(gè)，其中41個(gè)（20.5%）有隨機(jī)側(cè)翼區(qū)，可以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，還獲得兩個(gè)小衛(wèi)星克隆。于紅[7]等從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中4 201條長(zhǎng)牡蠣EST開發(fā)10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，9個(gè)位點(diǎn)可以在C. plicatula和C. ariakensis中成功擴(kuò)增。李莉[8]等研究了在一個(gè)回交家系中 15個(gè)微衛(wèi)星的分離情況。Sekino[9]等通過長(zhǎng)牡蠣微衛(wèi)星富集文庫(kù)發(fā)現(xiàn)了123個(gè)包含引物設(shè)計(jì)區(qū)域的重復(fù)序列，設(shè)計(jì)了 9條分型引物，8個(gè)位點(diǎn)顯示多態(tài)性，并發(fā)現(xiàn)6、4、5個(gè)位點(diǎn)分別可以在C. sikamea, C. ariakensis, C. nippona中擴(kuò)增獲得預(yù)期大小的等位基因。Huvet[10]等應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)長(zhǎng)牡蠣和與之親緣關(guān)系很近的葡萄牙牡蠣 C.angulata進(jìn)行了分析，為這2種牡蠣在自然群體中存在雜交現(xiàn)象提供了證據(jù)。Sauvage[11]等通過掃描9 272個(gè)長(zhǎng)牡蠣EST－contigs設(shè)計(jì)22組微衛(wèi)星分型引物，顯示 18個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。雖然長(zhǎng)牡蠣中開發(fā)并應(yīng)用微衛(wèi)星引物有一系列相關(guān)報(bào)道，但在大規(guī)模開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記上存在缺陷。

而大規(guī)模開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記是推動(dòng)長(zhǎng)牡蠣分子遺傳學(xué)研究深入開展并走向應(yīng)用的必要條件。本文所開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記來自 FOSMID大片段文庫(kù)的末端測(cè)序，在微衛(wèi)星篩查的范圍、數(shù)目和類型上是傳統(tǒng)的富集文庫(kù)法開發(fā)微衛(wèi)星所無法比擬的。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Silvia[12]等在進(jìn)行遺傳學(xué)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)群體的樣本容量要大于30。本實(shí)驗(yàn)選用自然群體48個(gè)長(zhǎng)牡蠣個(gè)體。

1.2 基因組DNA的提取

取長(zhǎng)牡蠣肌肉，參照 Sambrook[13]等采用常規(guī)的酚/氯仿抽提的方法提取DNA。

1.3 微衛(wèi)星序列的來源

實(shí)驗(yàn)所用的序列來源為基因組測(cè)序時(shí)構(gòu)建的大片段fosmid文庫(kù)末端測(cè)序，該文庫(kù)的基因組序列覆蓋度達(dá)到10倍，共完成451.164條fosmid－end測(cè)序，雙向成功reads數(shù)為225.582對(duì)，測(cè)序深度覆蓋整個(gè)基因組的0.17×，充分保證了在全基因組的層面上進(jìn)行大規(guī)模的微衛(wèi)星篩查。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

利用軟件RIMER PREMIER 5.0設(shè)計(jì)引物，引物長(zhǎng)度在18～22 bp左右，GC含量在40%～60%之間，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度在100～250 bp之間，在序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)引物。總共設(shè)計(jì)了104對(duì)長(zhǎng)牡蠣微衛(wèi)星引物，由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.5 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系（15μl）：20 ng的基因組DNA、10×buffer緩沖液（20 mM Mg2+）、0.15 μl Tag酶、dNTP各0.2 mmol/L、引物各0.3 μmol/L。PCR反應(yīng)條件：95℃變性5 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。各對(duì)引物的退火溫度見表1。用12%非變性聚丙烯酰胺（丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺體積比為29︰1）凝膠電泳分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物，電泳液為1×TBE緩沖液，電壓300 V，電泳1～2 h（北京六一儀器廠DYY-Ⅱ型電泳儀，DYCZ-30型電泳槽），Gel-red染色，利用UVP凝膠成像儀成像。

1.6 引物的篩選和數(shù)據(jù)處理

104對(duì)微衛(wèi)星引物均先用長(zhǎng)牡蠣自然群體的 6個(gè)DNA樣本擴(kuò)增，能擴(kuò)增出條帶的引物即被初選，然后初選的引物用自然群體的 48個(gè)個(gè)體擴(kuò)增、跑跤。每對(duì)引物的電泳條帶按有條帶的記為 1，無條帶的記為 0，不同大小的條帶總數(shù)記為總等位基因數(shù)。

根據(jù)每個(gè)個(gè)體的條帶確定基因型，利用POPGENEGENE（VERSION 1.31）軟件統(tǒng)計(jì)微衛(wèi)星基因座的等位基因數(shù)（Observed number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）、觀測(cè)雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）、遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity index，I），群體間遺傳距離（Genetic Distance，Ds），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

參照Botstein 等[14]的方法計(jì)算多態(tài)性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）：

公式中，Pi、Pj分別為群體中第i和第j個(gè)等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)總共設(shè)計(jì)了104對(duì)引物，其中有54對(duì)引物能在長(zhǎng)牡蠣的6個(gè)樣本中擴(kuò)增出目的片段。用長(zhǎng)牡蠣自然群體的48個(gè)個(gè)體進(jìn)行分析，34對(duì)引物顯示多態(tài)性擴(kuò)增，占32.7%，20對(duì)引物顯示單態(tài)性擴(kuò)增，占19.2%。

2.2 遺傳多態(tài)性分析

在長(zhǎng)牡蠣自然群體的 48個(gè)個(gè)體樣本中分析了這些位點(diǎn)的多態(tài)性（圖1，圖2是T855-33引物分別在1～24和25～48個(gè)DNA樣本上的凝膠電泳圖）以T855-33引物為例，有等位基因7個(gè)，平均等位基因5.030 6，觀測(cè)雜合度0.520 8，期望雜合度0.809 6，并未偏離Hardy-Weinberg 平衡。

各位點(diǎn)分析如表1所示，結(jié)果表明：每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目在 2～8之間，平均等位基因數(shù)是5.0，觀測(cè)雜合度在0.065 2～0.795 5之間，期望雜合度在0.063 8～0.853 4之間。34對(duì)微衛(wèi)星分子標(biāo)記中有7對(duì)符合哈迪－溫伯格平衡，有27對(duì)或多或少的偏離平衡。

3 討 論

微衛(wèi)星分子標(biāo)記在分子遺傳育種、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析、親緣關(guān)系分析等方面得到了廣泛的應(yīng)用。目前開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記的主要途徑有3種：一是整個(gè)基因組序列測(cè)序，檢索到微衛(wèi)星序列，根據(jù)位點(diǎn)兩端序列設(shè)計(jì)引物；二是檢索基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)引物；三是利用SSR分子標(biāo)記的可轉(zhuǎn)移性和通用性，在相近物種中篩選可用的引物。雖然傳統(tǒng)的富集文庫(kù)法開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記的方法比較繁瑣，消耗大，但在未經(jīng)過基因組測(cè)序的物種中，也常利用此方法開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記。檢索基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的序列開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記，已有相關(guān)報(bào)道[7]。研究證明，利用微衛(wèi)星引物的通用性，可以在相近物種中開發(fā)SSR分子標(biāo)記，如李琪[15]等通過長(zhǎng)牡蠣基因和EST序列開發(fā) 15個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)這些微衛(wèi)星至少可以在C. plicatula, C. hongkongensis, C. ariakensis,C. nippona和C. sikamea中的一種中擴(kuò)增。對(duì)序列完全未知的物種可以利用微衛(wèi)星標(biāo)記的通用性來開發(fā)相近物種的SSR標(biāo)記，可以提高研究效率。

實(shí)驗(yàn)通過對(duì)整個(gè)基因組序列進(jìn)行測(cè)序，采用新方法在全基因組上篩查微衛(wèi)星序列，為大規(guī)模開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記，從而推動(dòng)長(zhǎng)牡蠣分子遺傳學(xué)研究深入開展并走向應(yīng)用提供必要條件。

表 1 34對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物序列Tab. 1 Sequences of 34 novel polymorphic microsatellite loci for the Pacific Oyster Crassostrea gigas

續(xù)表1

表 2 34對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物特性Tab. 2 Characterization of 34 novel polymorphic microsatellite loci for the Pacific Oyster Crassostrea gigas

致謝：中國(guó)科學(xué)院海洋研究所李娟、王家豐、王威對(duì)實(shí)驗(yàn)的幫助，在此表示感謝。

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Development and characterization of SSR in Genome for the Pacific Oyster Crassostrea gigas

HAN Fei-fei1,2, QI Hai-gang2, LI Li2, ZHANG Guo-fan2, YAN Xi-wu1, LI Hui-juan1,2,YANG Fei1, WANG Lin-nan1

(1. Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

The Pacific Oyster (Crassostrea gigas) was introduced into China from Japan in 1980s. Since then, the Pacific Oyster culture has been one of the important mollusks in China. Microsatellite (Simple Sequence Repeats,SSRs) sequences were screened from the whole genome, which has advantage over the traditional microsatellitescreening method including the scope, number and type of microsatellites. Primers were designed for one hundred and four SSR loci derived from genome microsatellite sequences. Fifty-four primer pairs amplified the target DNA fragments and 34 primer pairs were polymorphic in the Pacific Oyster, accounting for 51.9﹪ and 32.7﹪ of the total designed SSR loci. The polymorphisms of these loci were analyzed in 48 individuals from a natural population. The number of alleles per locus ranged from 2 to 8 with average of 5.0. The observed heterozygosity ranged from 0.0652 to 0.7955, and the expected heterozygosity ranged from 0.063 8 to 0.853 4. Seven of 34 microsatellite markers accord with Hardy-Weinberg equilibrium (HWE), and 27 markers show more or less bias from HWE. These SSRs can be used in inheritance cross-breeding, linkage genetic mapping, and other domains in the species.

Crassostrea gigas; Microsatellite; Marker development; Genome

Q751

A

1001-6932(2011)05-0566-06

2011-03-11；

2011-05-11

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃項(xiàng)目，2010CB126402）；國(guó)家自然基金（40730845）；國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)（3-53）；中國(guó)博士后基金（20090461270）。

韓斐斐（1984－），女，碩士研究生，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖分子生物學(xué)研究。電子郵箱：hanfeifei0325310406@126.com。

閆喜武，教授。電子郵箱：yanxiwu2002@163.com。